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液相色谱新进展 －超高效液相色谱 Waters公司的UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography (超高效液相色谱） Agilent公司的RRLC: Rapid Resolution Liquid Chromatography （快速高分离度液相色谱） 一、定义： 用细粒径填料（sub-2μm) 、细内径柱子获得柱效高达(100,000-300,000/m)的液相色谱技术，简称超高效液相色谱 为什么关注小颗粒色谱填料？ 根据Van Deemter方程H=A+B/v+Cv 颗粒度越小，HETP越低，柱效越高，分离度越好 对于小颗粒，通过高流速获得高分离速度 对于小颗粒，提高流速时HETP不会提高－提高分离速度 二、基本原理 节约时间 节约溶剂 超高灵敏度 超高分离度 缺点： 高压力 Agilent RRLC 约450bar Waters UPLC 约700bar 优点： 三、优缺点： 西洋参成分的分离比对 HPLC UPLC 4.6×250mm，5μm 2.1×50mm，1.7μm 1、提高分离速度 小颗粒填料的速度优势 分离度RS∝L/ dp，即保持L/ dp，同比缩短柱长,以提高分离速度 提高流速－小颗粒填料的保持柱效，不降低分离度 提高速度的辅助手段 温度 不同色谱柱和温度的分离速度比对 2、提高分离度和灵敏度 提高L/ dp （ dp变小）－提高柱效－提高分离度 对于4.6×150mm，5μm色谱柱， L/ dp ＝30 对于4.6×150mm，1.8μm色谱柱， L/ dp ＝83.3 -改善分离度，保持分离速度 对于4.6×100mm，1.8μm色谱柱， L/ dp ＝55.6 -改善分离度，提高速度 分离度：颗粒对药物杂质分离的影响 改善分离度和灵敏度 四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪） 1、分离目标化合物： 根据中国药典（2005年版）确定分离人参皂苷Rg1、Re与Rb1，结构如下： 2、药典色谱条件 样品：西洋参提取液 仪器：Agilent 1100高效液相色谱系统 流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱 四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪） 色谱柱：ZORBAX SB C18 4.6×150 mm，5μm 柱温：40 oC 流速：1.0 mL/min 检测波长：203 nm 进样量：5μL 四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪） HPLC色谱柱规格: 4.6 x150 mm，5μm , (L/dp=30)。 根据L/dp值初步确定RRLC色谱柱规格：4.6 x 50mm，1.8μm， (L/dp≈28） 故可以获得相近的分离效率，但分离速度大大提高，并且可以改善灵敏度。 3、色谱柱的选择： 四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪） 4、方法转换的初步参数确定 在Method Translator相应栏目中输入原始HPLC条件，包括HPLC色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数，并选择RRLC色谱柱的规格，即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的RRLC分离的初步参数。 五、方法优化： 由于人参皂苷Rg1、Re未达到基线分离，可通过温度进一步优化分离 四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪） 应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪） 6、RRLC色谱条件确定： RRLC色谱条件： Agilent 1200高分离度快速液相色谱(RRLC)，色谱柱： ZORBAX SB C18 4.6x50mm, 1.8um 流动相：A: 0.1% H3PO4， B: 乙腈， 梯度分离 柱温：25oC 流速：2mL/min 检测波长：203nm 进样量：5μL 四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪） 7、西洋参分析：HPLC与RRLC分离色谱图比较 在RRLC系统上可以实现HPLC分离,此外还可以大幅度缩短分析时间，降低溶剂消耗，大大提高工作效率。 与HPLC相比，在保持相同进样量的前提下，使用小颗粒填料的RRLC可以显著改善分离灵敏度。 温度对RRLC分离影响较大，可通过调节温度改善分离度，或加快分离速度，节约时间 四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪） 8、结论 五、展望及结语 填料粒径进一步减小增大柱效，进