然后进行Sanger测序反应.pptVIP

  1. 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
  2. 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  3. 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  4. 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  5. 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  6. 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  7. 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
然后进行Sanger测序反应

第 三 节 核 酸 序 列 分 析 Nucleic Acid Sequence Analysis 钟树荣副教授 昆明医科大学法医学院 DNA序列测定(Determination of DNA sequence ) 核酸DNA分子一级结构的测定,是现代分子生物学一项重要的技术。    1963年,Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定,这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期,Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列测定的方法,Sanger双脱氧末端终止法和MaxamGilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段,使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易,这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。 DNA测序技术 (DNA sequencing technology ) 测序(sequencing )的常用方法 化学裂解法测序(Chemical pyrolysis sequencing )的原理 1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系,随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个,产生一组一端为放射线标记的末端,另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离,放射自显影得到互相错落的梯形图谱,即可读出DNA序列 二、Sanger双脱氧链终止法 在DNA合成时,利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链上使链终止的原理。即在A、C、G、T 4种反应体系中,分别加入不同的ddNTP,其他试剂相同,经酶促合成反应,生成具有相同的5′末端,而3′不同的DNA片段的混合物。经电泳分离,放射自显影,直接读出DNA的核苷酸序列。 Sanger双脱氧链终止法 DNA测序自动化和大规模测序的特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h DNA自动测序 Four color fluorescent dyes (BigDye)Mark end item DNA测序基本步骤 (Basic steps in DNA sequencing ) 测序模板的纯化与定量 测序反应--PCR仪 测序反应产物纯化与变性 上样电泳--测序仪 分析结果 DNA sequencing pruduct purification DNA number of sequenced templates Sequencing reaction system and condition Sequencing reaction single-cell ge l electro phoresis--377 single-cell ge l electro phoresis--310 single-cell ge l electro phoresis--3100 Step1:The capillaries glue Step2:specimen disc move Step3:electrophoretic injection and electrophoresis Step4:Fluorescence excitation and detection DNA automatic sequencing result DNA sequencer 的多种应用 DNA automatic sequencing result * * * * DNA序列测定常用方法有如下3种: 1、高负荷,1块胶可测16个样品;2、机读不需放射自显影;3、安全不用同位素;4、简单迅速8-10h。 不需酶促反应,可以对寡核苷酸测序。 简便、迅速、应用广泛。 优点 类似末端终止法,所不同的是用荧光染料标记,计算机自动读出。 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段,产生一簇各种长度的短链,经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。 使用特异性引物与单链模板DNA退火,在DNA聚合酶作用下进行延伸反应,用ddNTP终止,用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA,从而完成测序的方法。 3、DNA测序自动化 2、化学裂解法 1、末端终止法 一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法) 基本原理 Maxam-Gilbert法(1977年)要对原DNA进行化学降解。即用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段,产

文档评论(0)

sunshaoying + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档