产绿原酸内生菌的分离及其绿原酸合成途径关键基因的克隆和功能研究.pdfVIP

微生物学通报 Oct. 20, 2015, 42(10): 1888−1894 Microbiology China © 2015 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.141002 研究报告 产绿原酸内生菌的分离及其绿原酸合成途径关键基因的 克隆和功能研究 * 王川 李丽 魏丕伟 黄非 ( 四川理工学院 生物工程学院 四川 自贡 643000) 摘 要：【目的】分离产绿原酸的内生菌并对其绿原酸合成途径的一种关键酶基因进行克隆和功 能研究。【方法】采用表面消毒法从金银花中分离内生菌，以高效液相色谱(HPLC)和液相色谱- 质谱联用(LC-MS) 筛选确定产绿原酸的内生菌，克隆、表达该内生菌的组氨酸解氨基酶(HAL)并 进行酶活测定。【结果】从金银花根中分离到一株产绿原酸的内生细菌RP1 ，同时在该内生菌发 酵液中检测到了绿原酸代谢的中间物肉桂酸。对 RP1 的分子鉴定表明该内生菌为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 。对RP1 的HAL 基因进行克隆和原核表达，酶活测定表明该酶具有HAL 和PAL (苯丙氨酸解氨基酶)双功能，其PAL 活性产生的肉桂酸与LC-MS 检测的结果一致。【结论】推测 该内生菌可能利用其 HAL 的苯丙氨酸解氨基活性将苯丙氨酸的催化产物肉桂酸导入苯丙烷途 径，从而产生绿原酸。 关键词：绿原酸，内生菌，分离，HAL 基因，活性 Isolation of chlorogenic acid-producing endophyte and cloning of a key gene of chlorogenic acid synthetic pathway * WANG Chuan LI Li WEI Pi-Wei HUANG Fei (College of Bioengineering, Sichuan University of Science Engineering, Zigong, Sichuan 643000, China) Abstract: [Objective] To isolate a chlorogenic acid (CGA)-producing endophyte, and to study the function of a key gene of the CGA synthetic pathway from the endophyte. [Methods] Endophytes were isolated from Flos Lonicerae japonicae by surface sterilization. The endophytic bacterium producing CGA was screened and confirmed by HPLC and LC-MS. Histidine ammonia lyase (HAL) gene of the endophytic bacterium was cloned and expressed in Escherichia coli and enzyme activity of the recombinant HAL w