western_blot_常见问题分析.docxVIP

Western Blot已经成为实验室中检测蛋白质的常规手段。不过想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。我们在做蛋白电泳和Western Blot时，多数都用的Bio-Rad公司的仪器，所以Bio-Rad蛋白方面的技术专家的确可以称之为专家，因为每天都有很多人向他们请教。他们就将最常见的问题整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我们节选了一部分，希望能帮你节省一些查资料的时间。. Q：我的结果是膜上一片空白。为什么会这样？. A：导致这种结果的因素很多。. 胶和膜放反了 如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。. 转膜效率低 转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的pH值。一般说来，蛋白越大，转移得越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会穿出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2 um孔径的NC膜或PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中也几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐（pH9.9）、CAPS（pH11）及酸性缓冲液。. 在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率，Bio-Rad也提供了多种预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。. 试剂放置太久或存放条件不正确 抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。底物应储存在-20°C。. 抗体不纯或滴度太低 一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及，太多的抗体也会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。. 酶失活了 叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要在HRP显色的western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。另外，自来水或用聚苯乙烯树脂去离子的水也可能会使酶失活，只能使用蒸馏的去离子水。. 使用Tween-20洗涤 Tween-20（吐温-20）可能会干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗走NC膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%，但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤，其他洗涤过程中都不使用Tween-20，不过，这可能会使背景升高。. 检测系统缺乏足够的灵敏度 确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内：. 辣根过氧化物酶 500 pg/band 碱性磷酸酶 100 pg/band. 增强的碱性磷酸酶 5 pg/band 胶体金 100 pg/band. 增强的胶体金 10 pg/band Immun-Star 化学发光 10 pg/band. Q：我的western blot总是背景过高，如何解决？. A：背景过高可能是由很多因素引起的：封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。. 封闭不完全 一抗或二抗只要结合到膜上，就会显色。为了避免非特异性的结合，应用封闭液孵育膜，使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能在4℃孵育，因为它会凝结。如果想要低温封闭的话，可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景。. 显色过度 显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久，背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰可见，而背景几乎没有或很少时，将膜及时取出。. 洗涤不充分 在封闭以及抗体孵育之后，至少要洗两次膜，每次5分钟。去污剂的浓度不要太高，否则会把抗原从膜上洗下来。. 转移缓冲液或设备污染 使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净。海绵垫也一定要认真清洗。脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外，每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。. 抗体稀释度不正确 一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说，以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。抗体稀释度不够，会产生非特异的结合，带来高背景。. 二抗不纯 没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用，产生杂带。. Q：在转膜的过程中，缓冲液总是很热