植物生理学实验叶绿体色素的定量测定2009.pptVIP

叶绿体色素的定量测定 * 植物生理学实验 植物体内的叶绿体色素与光合作用有非常密切的关系。植物叶片的叶绿体色素含量常因栽培技术，氮素营养水平、植物种类等不同条件而有很大变化。因此，在肥水技术、育种、丰产性能及植物病理等研究上常有测定的需要。 一、目的意义 叶绿体色素 叶绿素 类胡萝卜素 叶绿素a 叶绿素b 叶黄素 胡萝卜素 3/1 2/1 3/1 植物生理学实验 叶绿素的化学结构 植物生理学实验 胡萝卜素 二、原理 该方法由Anorn于1949年建立。根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯-比尔 定律，某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即： D=kCL 式中：k为比例常数。 当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得： k＝D/C 将叶绿体色素利用纸上色层分离方法得到的各种色素（单一纯度的），配成已知浓度的溶液，测定不同波长下的D，就可以计算k值。 植物生理学实验 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，即光密度的加和性： Dλ总＝dλ1+ dλ2+ dλ3+…….+ dλn 植物生理学实验 叶绿素a、b在红光区和蓝紫光区有吸收峰 类胡萝卜素的吸收峰与叶绿素吸收峰在蓝紫光区重合 叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异。在使用不同溶剂提取色素时，计算公式有所不同。 本实验以 96％乙醇为例。 植物生理学实验 已知叶绿素a、b的96%乙醇提取液在红光区的最大吸收峰：a＝665nm；b＝649nm 根据有色物质的加和性，建立方程组： D665=Kaλ665 Ca+ Kbλ665 Cb D649=Kaλ649 Ca+ Kbλ649 Cb 将测定的k值常数代入公式，解方程得： Ca（mg/L）=13.95D665 – 6.88D649 Cb（mg/L）=24.96D649 – 7.32D665 96％乙醇提取 类胡萝卜素的最大吸收峰在470nm C类=D470/K类470 470nm下，叶绿素a、b都有吸收，一定要减 a、b的消光度值。 K类470 ＝245 计算类胡萝卜素的公式： Cx·c(mg/L)=(1000D470–2.05Ca–114.8Cb) / 245 植物生理学实验 叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰： 663nm和645nm 663nm下，叶绿素a、b的比吸收系数： Ka663＝82.04 Kb663＝9.27 645nm下，叶绿素a、b的比吸收系数： Ka645＝ 16.75 Kb645＝ 45.60 80％丙酮提取 根据加和性原则列出以下关系式： D663 = 82.04Ca+9.27Cb D645 = 16.75Ca+45.60Cb 解方程组得： Ca (mg/L)= 12.72D663 – 2.59D645 Cb (mg/L)= 22.88D645 – 4.67D663 Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： CT (mg/L)= Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663 植物生理学实验 由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次光密度（D652）而求出叶绿素a、b总量： CT (mg/L)=(D652×1000) / 34.5 植物生理学实验 在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。80%丙酮提取液中三种色素含量的计算公式： Ca (mg/L)= 12.21D663 – 2.81D646 Cb (mg/L)= 20.13D646 – 5.03D663 Cx