《免疫酶技术》.ppt

免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是将抗原－抗体反应的特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合，由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优点，又避免了他们的缺点。这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。 目前可选用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、 碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、β－D半乳糖苷酶（β－D－Gal）等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质相对较稳定且价格适中，广泛地被临床和实验室所应用 多聚螯合物法(ELPS) 多聚螯合物法的特点 多聚螯合物法应用了一种突破性的技术即多聚物技术，其在一条多聚肽链上螯合了相对应的第二抗和酶标志物。此法是近几年来发展较快的一种新的免疫组化技术，更由于酶连接方式较为直接，可进一步降低操作时一抗的工作液浓度，可使反应更灵敏、整个背景染色更低、染色时间短等特点。目前在临床上，特别是临床病理被广泛应用。 该法也可分为一步法和二步法。一步法是将多聚物酶 分子直接结合在特异性一抗上，而二步法是将多聚物酶 分子连接在第二抗体上。 免疫酶细胞化学技术 1．标本选择的特点 免疫酶标法可选择骨髓涂片或抽取一定量骨髓液用淋巴细胞分离液提取出单个核细胞。采用涂片机涂片，无论选用何种方法，均要求标本新鲜。虽然本法是抗原-抗体结合反应，但标本采集过久，会造成细胞表面抗原的丢失。特别是淋巴细胞相关抗原。通常标本采集一周后，其阳性率可明显下降。 2．涂片的要求 无论采用何种酶标记法，若用涂片法则需要将涂片完全干燥以后方能检测。若不干燥，在操作过程中易发生脱膜现象。虽然在前处理时有固定这一步，但为了使细胞表面的分化抗原少受因固定带来的损失，往往选择的固定剂和固定时间均不十分满意。若较薄的涂片标本干燥72小时，可省略固定这一步，能提高部分细胞分化抗原的阳性表达。但必须控制好试验的渗透压，以免细胞破坏。 3．标本的保管 标本采集后至结果观察完毕以前，应尽可能避免接触与实验无关的化学物品。特别是苯、二甲苯、醚、乙醇、双氧水、醛等实验室常用试剂。因这些试剂具有强烈的凝固或氧化蛋白质的作用。使细胞表面的分化抗原减少，甚至失去，造成假阴性。 4．试剂的准备 各种试剂购进后，特别是单克隆抗体，除参考产品说明书，尚需结合各自的实验室条件，选定最佳稀释速，即调整一抗、二抗、三抗等之间的浓度，以求获得最佳特异性染色效果和最低的非特异性背景干扰。同时每次检测均需设置阳性细胞和阴性细胞的对照，以检查方法的可靠性。 5 非特异性结合的防止 抗体和组织成分的非特异性结合（Fc受体），也可引起非特异性染色。另外，由于电荷性关系，抗体的阴电荷与组织中带阳电荷的蛋白质发生非特异性粘附，此时可加入与二抗同一种属源性的血清加以封闭。 6．抗体孵育操作不当 可造成的背景吸附及阳性细胞呈局限状产生，使结果产生假阳性和假阴性。所以在整个操作过程中均需在湿盒内进行，并注意加抗体时勿使涂片干枯以免造成抗体分布不均。 7．结果观察 结果观察要及时，酶标法虽然可保存较长时间不褪色，但不如新鲜时颜色鲜艳，易观察。如对结果有疑问，可重复操作，加以证实。 8．阳性反应的了解 在检测前应明确被检细胞的分化抗原所在的部位，即在细胞膜表面和细胞浆中及细胞核内，以利标本的前处理和阳性结果的准确判断，以免造成假阴性或阳性结果的误判、漏判。 9．结果的比较 结果观察的同时，必须对同一标本的普通染色片（瑞氏染色或H-E染色）和细胞化学染色结果进行观察和比较，进一步确定具有临床意义的病理性细胞和其免疫标记的阳性情况，尽可能减少误诊和漏诊。 10．阳性标准的确定 结果判断由于受检测方法、试剂盒的特异性及敏感性，以及操作技术熟练程度等因素的影响，其结果判断的标准化问题尚难统一。但必须掌握阳性细胞定位明确，间质清晰，无背景染色，病理性细胞阳性表达在5%以上，才可视为阳性。 标本种类 可选择：① 新鲜血涂片或骨髓涂片。 ② 体液标本可离心后取沉淀物涂片。 ③ 实体肿瘤标本可采用 a 印片法、 b 穿刺涂片法、c 匀浆法等。 总之，一切有细胞的标本经过处理制成涂片 后均可检测。特别适合对细胞的定性。 划分前 免疫细胞化学染色方法学的选择及评价 免疫组化染色的方法较多，同时方法的选择，由于各种免疫组化技术各有特点，各有所长，所以不能一概而论地选择某一种方法好。对免疫组化技术的普及和长期开展较为重要。特别是一些基层医疗单位，若能根据各科室实际情况，依据标本的数量和病种，选用合适的免疫组化技术与单克隆