第十一讲1目的基因的获得.pptVIP

目的基因 需要克隆的DNA片段。 编码某种蛋白质 研究某基因结构和功能的关系 研究某基因与疾病的关系 目的基因的获得 PCR 化学合成法 cDNA文库 基因组DNA文库 基因差异表达 1 PCR技术获得目的基因 1.1 已知序列基因的PCR扩增 1.2 RT-PCR 1.3 RACE (cDNA末端的快速扩增) 1.1 已知序列基因的PCR扩增 ⑴引物设计； ⑵引物效果检验和PCR参数确定。 1.2 RT-PCR 原理： 利用逆转录酶能将mRNA逆转录成cDNA的特性，通过合适的引物，将细胞内的mRNA逆转录成cDNA。 然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。 逆转录步骤 cDNA 链合成： 一般利用polyT作为引物，也可用特异性的序列作为引物 G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAA Reverse transcriptase mRNA cDNA T T A G G A G TTTTTTTTTTTTTTT 逆转录polyT引物 RT-PCR的优点： ⑴不需要纯化mRNA，总RNA就可以作为合成单链cDNA的模板； ⑵单链cDNA合成后其3‘端要进行同聚物加尾，不会丢失末端的最后几个核酸，可得到相当于mRNA5’末端的比较完整的序列。 1.3 RACE 以mRNA为模板，反转录合成cDNA第一链，然后用PCR技术扩增从某个特定位点到3‘端或到5’端之间的未知核苷酸序列。 这里的3‘端和5’端是针对mRAN而言。 RACE的技术流程 ⑴分析核心区段 经过比对分析，找出同源性较强的序列，然后根据核心序列设计引物。 来源：蛋白质、cDNA RACE的技术流程 ⑵ 设计简并引物和扩增核心区域 RACE的技术流程 ⑶ 设计RACE引物并进行3‘RACE和5’RACE 扩增的核心区域克隆和测序后，既获得目的基因中间部分的序列，根据这一序列分别设计RACE引物。 3‘RACE： 上游引物：根据中间核心序列设计 下游引物：oligo（dT） 利用cDNA第一链为模板将cDNA3’端扩增出来 5‘RACE 下游引物：根据核心序列设计 上游引物： ⑴将mRNA5’端的帽子结构切除，然后利用连接酶接上一段已知序列的寡核苷酸； ⑵特殊的反转录酶在cDNA末端加碱基； ⑶TdT的应用。 2 根据基因差异表达获得目的基因 DD-PCR （mRNA差异显示技术）： 2.1 以锚定引物合成cDNA第一链 Poly(A)5‘上游的两个碱基只能有12种不同的组合。 oligo(dTMN) （3’端锚定引物） M=A、C、G N=A、G、C 、T 2.2 以5‘端随机引物和3’锚定引物进行PCR 2.3 PAGE 2.4 回收差异条带，利用差异条带制备探针进行cDNA文库或基因组文库的筛选。 3 化学合成法获取目的基因 1979年，Khornan等首次用化学的方法合成了一种具有生物活性的大肠杆菌酪氨酸转移酶核糖核酸基因，开创了基因化学合成的先例。 3.1 寡核苷酸单链的化学合成 主要做PCR引物、测序引物和PCR定点诱变 3.2 探针的合成 3.3 连接子和接头的合成 3.4 基因的半合成 3.5 全长基因的合成 目前，化学合成寡核苷酸片段的能力是150—200bp，绝大数基因，尤其是高等生物的基因，大小超过这个范围。因此，要有适当的方法来获得完整的基因。 思考题： 目的基因的获得方式有哪些？