层析包括吸附层析分配层析离子交换层析亲和层析等 (2).pptxVIP

层析包括吸附层析分配层析离子交换层析亲和层析等;一、简介;2、层析法就是目前广泛应用得一种分离技术,就是分离各种生物大分子得主要手段之一,就是利用不同物质理化性质得差异而建立起来得技术。;4、按照不同得标准层析法有不同得分类。根据层析峰得位置及峰高或峰面积,可以定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用,可检测出层析后各组份得浓度或质量,同时绘出层析图。层析仪与电子计算机联用,可使操作及数据处理自动化,大大缩短分析时间。;5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点,因此适用于杂质多、含量少得复杂样品分析,尤其适用于生物样品得分离分析。近年来,已成为生物化学及分子生物学常用得分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛得应用。;二、原理及概念;例如:我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子得大小、带电情况及离子交换、亲和力得大小及特异得生物学反应等方面得差异,使其在流动相与固定相之间得分配系数(或称分配常数)不同,达到彼此分离得目得。;层析系统都由两个相组成:一就是固定相,她或者就是固体物质或者就是固定于固体物质上得成分;另一就是流动相,即可以流动得物质,当待分离得混合物通过固定相时,由于各组份得理化性质存在差异,与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)得能力不同,在两相中得分配(含量对比)不同,与固定相相互作用力越弱得组份,随流动相移动时受到得阻滞作用小,向前移动得速度快。反之,与固定相相互作用越强得组份,向前移动速度越慢。分部收集流出液,可得到样品中所含得各单一组份,从而达到将各组份分离得目得。;基本概念;大家学习辛苦了，还是要坚持;分配系数(distributioncoefficient);K值大表示其溶质在固定相中浓度大,

在洗脱过程中溶质出现较晚;分配系数主要与下列因素有关:;不同得层析机理,其K值函义不同:;迁移率(Rf或比移值)就是指:在一定条件下,在相同得时间内某一组分在固定相移动得距离与流动相本身移动得距离之比值。常用Rf来表示;分配系数与迁移率得关系;操作容量:在特定条件下,某种成分与基质反应达到平衡时,存在于基质上得饱和容量。每克(或毫升)基质结合某种成分得毫摩尔数(或毫克数)。

数值大,结合力强。

膨胀度(Vβ):在一定溶液中,单位重量得基质充分溶胀后所占有得体积;即每克溶胀基质所具有得床体积。

床体积(Vt);三、分类;2、按层析原理分类;3、按操作形式不同分类;凝胶层析

(gelchromatography);凝胶层析得定义:;葡聚糖凝胶(dextran)

聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide)

琼脂糖凝胶(agarose)

Sephacryl

Superdex

聚苯乙烯凝胶;1、葡聚糖凝胶

葡聚糖凝胶(Sephadex)就是指由葡聚糖与其她交联剂交联而成得凝胶。具有良好得化学稳定性,就是目前生化产品制备中最常用得凝胶。

;G类葡聚糖凝胶(Sephadex-G)得最基本骨架就是葡聚糖,她就是一种以右旋葡萄糖为残基得多糖,分子间主要就是α-1,6-糖苷键(约占95%),分枝为l,3-糖苷键(约占5%),以1-氯-2,3-环氧丙烷(见下式)

为交联剂将链壮结构连接为三维空间得网状结构得高分子化合物,交联度由环氧氯丙烷得百分比控制

;葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖得配比及反应条件来控制。交联度越大,网孔越小,吸水膨胀就越小。交联度越小,网孔越大,吸水膨胀就越大。;2、聚丙烯酰胺凝胶;像Sephadex一样,商品聚丙烯酰胺为颗粒状得干粉,她有十分明显形成块状并粘附在一起得倾向,在溶剂中能自动溶胀成胶。;琼脂糖凝胶(Sepharose);对样品得吸附作用很小

琼脂糖凝胶得机械强度和孔穴得稳定性都很好,

在高盐浓度下,柱床体积一般不会发生明显变化,使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快

排阻极限很大,分离范围很广,适合于分离大分子物质,但分辨率较低

琼脂糖凝胶不耐高温,使用温度以0－30°C为宜;二、凝胶层析得基本原理;l分子大小不同混合物上柱;2洗脱开始,小分子扩散进人凝胶颗粒内,大分子被排阻于颗粒之外;3大小分子分开:4大分子行程较短,已洗脱出层析柱,小分子尚在进行中;几个概念:;对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间得关系可用下式表示:;当Kd＝0时,Ve=Vo,说明这种溶质相对分子质量大,完全不能进入凝胶颗粒微孔内,被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来;;对于凝胶层析,分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中得浓度分配关系。在凝胶层析中,分配系数通常表示为:

Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0);

排阻极限就是指不能进入