小鼠肝脏组织总RNA的提取注意事项RNA酶a广泛存在灰尘.pptVIP

35 35 吉林大学基础医学院 分子生物学教研室 RNA extraction 实验内容 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 注意事项 RNA酶：a. 广泛存在——灰尘、人体唾液、实验器材表面。 b. 生物活性非常稳定——耐热、耐酸、耐碱。 1、 抑制外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净（带手套、口罩） B. 用新开封的化学试剂（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、 抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。 RNA分离关键因素：避免RNA酶的污染。 1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20-200个A，翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt 真核细胞的总RNA 1) 实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 2) 将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mL Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上。 使组织细胞充分裂解，可见液体变成均匀浑浊状。 3) 室温孵育10 min。（使核酸蛋白复合物完全分离） 一、小鼠肝脏组织RNA提取的实验操作 1、异硫氰酸胍法 GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 RNase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素可结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。 RNA提取的几种方法 1、DEPC ( 二乙基焦炭酸盐)：最常用的RNase抑制剂 与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白变性； 工作浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。 用于浸泡各种器材。 　 灭活条件：高压。 试剂配制：无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压) 储存方法： 4 ?C 或液氮。不能用聚苯乙烯器皿。 2、肝素： 工作浓度：0.1—10mg/ml 可与DEPC联合应用， 具有极强的效果。 3、RNasin 其可直接抑制RNA酶活性 RNase抑制剂 4) 加入200 ?l氯仿， 震荡混匀20-30s， 室温放置5 min 此期间液体开始分层， 不要轻易搅动液体 5) 10000rpm 离心 5min。 将清澈透明的上层水相（约500ul)转移至另一离心管中。 RNA (清澈透明) DNA Protein 注意！ 7) 加500 uL异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。 10, 000?rpm，4?C，离心10 min．弃上清。 8) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 注意： 75%乙醇的作用 — 不起沉淀作用，只是为了清洗管壁。 加入方法 — 贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀。 沉淀RNA 9) 7500rpm，4?C 离心 1 min，弃上清。 再离心几秒钟，用加样器将管壁液体完全移净。 10) 室温干燥3－5 min RNA pellet：透明胶样，干燥后应该无色透明 室温干燥 —— 避免在37 ?C 孵箱中过度干燥而无法溶解。 RNA沉淀必须绝对干燥 —— 微量乙醇残留，容易造成逆 转录反应的失败。 RNA沉淀干燥环节是逆转录成功的关键。 RNA干燥注意事项 11）溶解RNA：吸取9 ?l冰冷DEPC水，吹打溶解RNA。