生物素 亲合素放大技术维生素H动.ppt

第十一章 生物素-亲合素放大技术 维生素H 动、植物组织中广泛 分布,卵黄和肝含量高 MW 244.31kD. I环为咪唑酮环，可与亲合 素结合 Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸 侧链的未端羧基是结合生 物大分子的唯一结构 I 咪唑酮环 Ⅱ 噻吩环 羧基 第一节 生物素理化性质与标记 一、活化生物素 生物素侧链的末 端羧基经化学修 饰后制成带各种 活性基团的衍生 物－活化生物素 (生物素化衍生物) 生物素活化 活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物 标记蛋白质氨基的活化生物素 标记蛋白质醛基的活化生物素 标记蛋白质巯基的活化生物素 标记核酸的活化生物素 活化生物素 标记蛋白质氨基的活化生物素 BNHS分子可与蛋白质 赖氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质 生物素 N-羟基丁二酰胺 碳二亚胺 生物素羟 基琥珀酰 亚胺酯（ BNHS ） 如何减小空间位阻？ 长臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添 加了两个6-氨基已糖分子基团，形 成连结臂，生物素与大分子基团的 距离 标记蛋白质醛基的活化生物素 生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接 后，再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基 标记蛋白质巯基的活化生物素 马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) 能特异地与蛋白质巯基结合的活化 生物素 标记核酸的活化生物素 光生物素(photobiotin) 侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香 基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针 生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP） 作为TTP的结构类似物，可采用缺口移 位法掺入到双链DNA中。 BNHS和BHZ 可直接标记核酸， 但对碱基配对有影 响。 活化生物素通过侧链与蛋白分子连接； 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性； 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记微酸性抗原； 抗原、抗体标记后活性不变； 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后 活性将降低； 二、生物素标记蛋白质 选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性； 控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力 第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记 　　　亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。 结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基 PI 10.5 6 结合位 色氨酸 色氨酸 生物素 4 4 Ka 1015 1015 活性 13～15 15～18 亲合素（A） 链霉亲合素(SA) 一、理 化 特 性 二、亲合素/链霉亲合素标记 标记物：酶、胶体金 异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA) 过碘酸钠、戊二醛 ABC/SABC 预制AV(SAV)-Biotin 第三节 生物素-亲合素系统的特点 一、灵敏度 二、特异性 三、稳定性 四、适用性 五、其他 第四节 生物素-亲合素系统的应用 　　　生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。 一、生物素-亲合素系统基本类型及原理 BAB法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A Ag-Ab·B-A B·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E BA法 Ag+B·Ab Ag-Ab·B A·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以A-E/