从生物样品中分离纯化生物大分子培训讲解.pptx

从生物样品中分离纯化生物大分子方法及实践应用 报告人：王瀚辉 陈聪 王楠 赵一亮 指导教师：赵慧珊 时间：2014.12 概述 1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线 4.仪器及试剂 5.前期研究基础或预实验结果 概述 1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线 4.仪器及试剂 5.前期研究基础或预实验结果 1.课题研究背景 生物大分子是指生物体内广泛的活性物质，分子量上千上万甚至更大，多数生物大分子为多聚体。由简单有机化合物聚合而成。 20世纪以来，生物化学、分子生物学和细胞生物学生物迅猛发展，实验室里生物大分子的合成进步速度可观。大分子的分离纯化与鉴定一直以来是生物化学研究的基础，是生物化学工作者的重要基本功。生物大分子广泛存在于机体的各类组织中，以蛋白质、核酸、脂质、多糖为主。诸多生物大分子合成分离和纯化已经从实验室走向工厂化，因此生物大分子的相关技术尤为重要。 概述 1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线 4.仪器及试剂 5.前期研究基础或预实验结果 2.课题研究内容 1.从生物样品中分离纯化生物大分子 2.利用分离纯化生物大分子方法从肝组织中提取分离鉴定一种酶（该酶含三个大小不同亚基，pI=6.2。） 创新点 对该酶的特性结果及分子量不明确，无法利用分子量差异分离，但可以利用其等电点完成分离。鉴定过程中利用SDS电泳技术可以鉴定亚基情况是否是符合要求。 概述 1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线 4.仪器及试剂 5.前期研究基础或预实验结果 1.提取对象选择：确定细胞内目标分子的种类，和目标分子的位置。 2.制定提取方案：确定一套能够确定完善分离高纯度目标分子的方法。 3.文献查阅和前期预备性实验：通过文献资料掌握四种分子理化性质，完善计划，确定分离途径、 4.生物材料的处理：生物大分子来源通常为生物组织或微生物菌落，首先需要破碎组织。 4.1机械法： 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。(植物微生物） 4.2物理法： 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。 4.3化学与生物化学方法： 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 5.生物大分子提取方法 5.1.核酸的分离纯化 5.1.1分离纯化原则： （1） 保持核酸分子一级结构的完整性 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 具体原则：温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9); 保持一定离子强度; 减少物理因素对核酸的机械剪切力。 （2） 防止核酸生物降解 DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂 RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素；复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物 5.1.2 分离纯化的步骤： (1)去除杂质：生物样品内常含有大量多糖，脂质，蛋白质等杂志，利用物理或化学方法将其除去。 (2)浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。 (3)测定：一般选用紫外分光光度法或溴乙锭荧光法测定