苗木抗旱性生理实验方法.docVIP

2 试验方法 2.1 试验设计 试验采用盆栽试验的方法，将苗木移栽入合适的花盆中，给予较好的管护。待苗木成活生长稳定后开始试验。每个品种都设置对照株（给予充足水分）。试验组以时间为梯度（0d,6d,12d,18d,24d,30d,36d），采用自然干旱的办法，每隔6天对各项指标进行监测，同时监测土壤中水分的变化。 2.2 指标及监测方法 2.2.1 叶片水分状况 （1）组织含水量的测定 仪器和用具：电子天平（感量0.1mg），烘箱，剪刀，100ml 烧杯，铝盒，吸水纸 试剂： 剪取组织，迅速放入已知重量的铝盒中，称出鲜重（Wf）；然后将组织浸入蒸馏水中6-8h，取出用吸水纸擦干表面水分，称重，再将组织浸入蒸馏水中1h，擦干称重，直至组织重量稳定恒重，既得样品饱和鲜重（Wt）；然后将组织连同铝盒放入已升温至105℃的烘箱中，杀青15min，然后于80℃下烘至恒重，称出干重（Wd）； 组织含水量（占鲜重）= （Wf- Wd）·100%/ Wf 组织含水量（占干重）= （Wf- Wd）·100%/ Wd 相对含水量（RWC）=（Wf- Wd）·100%/（Wt- Wd） 水分饱和亏（WSD）=1-RWC （2）离体叶片保水力测定 剪取各个品种各个处理叶片迅速将其插入蒸馏水中，饱和3小时以上，取出叶片，剪去叶柄，称量叶片重量。然后将叶片悬于室内，在空气中缓慢脱水（记录室温和RH），每隔两个小时称重一次，称4次后，知道24小时再称重1次，将叶片在80℃下烘干称干重。根据所得数据计算出每次称重时的叶片含水量，再以脱水时间对叶片相对含水率作图，可得叶片保水力的差异。 2.2.2 光合指标 （1）叶绿素a、叶绿素b、叶绿素和类胡萝卜素含量的测定 仪器和用具：分光光度计，研钵一套，剪刀，玻棒，25ml棕色容量瓶3个，小漏斗3个，直径7cm定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管，电子天平（0.01g感量） 试剂：96%乙醇，石英砂，碳酸钙粉 a 取不同油茶品种苗木的新鲜叶片，擦净表面剪碎（去掉中脉），混匀。 b 称取剪碎的新鲜样品0.2g（共三份），放入研钵加入少量石英砂和碳酸钙粉及2-3ml96%乙醇研成匀浆，再加入乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3-5min。 c 取滤纸一张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量???中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 d用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止，最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 e 把叶绿体色素提取液倒入比色杯，以96%乙醇为空白，在波长665、649、470nm下测定消光度。 Ca=13.95D665-6.88D649 Cb=24.96D649-7.32D665 CX·C=（1000D470-2.05Ca-114.8Cb）/245 叶绿素含量（mg/cm2）=叶绿素浓度×提取液总体积×稀释倍数/样品鲜重 叶绿素a含量（mg/cm2）=叶绿素浓度×提取液总体积×稀释倍数/样品鲜重 叶绿素b含量（mg/cm2）=叶绿素浓度×提取液总体积×稀释倍数/样品鲜重 类胡萝卜素含量（mg/cm2）=叶绿素浓度×提取液总体积×稀释倍数/样品鲜重 （2）光合速率、蒸腾速率、气孔导度和水分利用效率的测定 用Lico-6400便携式光合测定分析仪(美国)进行光合测定，在不同处理的树冠中部向阳选取正常生长的功能叶，测定叶片的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci），并计算水分利用效率（WUE）=Pn/Tr。每个样品至少3次重复，结果取平均值。 2.2.3 生理生化指标 （1）丙二醛的测定 采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定。样品提取方法与酶夜提取相同。测定时向具塞试管中加入2mL样品提取液和3mL 0.5%硫代巴比妥酸（TBA）溶液（用5%乙酸溶液溶解定容），沸水浴中煮沸10min后取出流水冷却，3000×g离心15min取上清液，以0.5%TBA为空白调零，分别在波长532nm，600nm和450nm下测OD值。结果按下式计算： 丙二醛含量（nmol·g-1FW）=[6.452×（D532-D600）-0.559×D450] × V×Vt×/(W×Vs) 式中，V：反应液总量，mL；Vt：提取液总体积，mL；Vs：测定用提取液体积，mL；W：样品鲜重，g。 （2）游离脯氨酸含量测定 采用磺基水杨酸提取，茚三酮显色法测定。 a 制作标准曲线：取7支25mL具塞试管，编号，按下表2