沙眼衣原体假定的包涵体膜蛋白免疫原性的筛选与鉴定.doc

沙眼衣原体pORF8质粒蛋白的表达及其单克隆抗体的制备与鉴定* 粟盛梅1，李忠玉1**，黄秋林2，钟光明3，周洲1，陆春雪1 （1.南华大学病原生物学研究所，衡阳421001；2.南华大学第一附属医院，衡阳421001；3.德州大学圣安东尼奥健康科学研究中心，德州 78229） 【摘 要】 目的 表达沙眼衣原体pORF8质粒蛋白，制备其单克隆抗体（mAb），并鉴定其生物学特征。方 法 克隆表达pORF8融合蛋白并免疫小鼠制备致敏的脾淋巴细胞，脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞株；免疫荧光实验（IFA）筛选稳定分泌抗pORF8蛋白mAbs的阳性细胞株并鉴定mAbs抗体类型；ELISA 法测定mAbs效价；IFA、western blot 鉴定mAbs特异性。结 果 筛选出3株稳定分泌特异性抗pORF8 mAb的杂交瘤细胞株，分别为5C2、12C7、12F8；抗体类型分别为IgM、IgG3、IgG3；杂交瘤细胞培养上清的抗体效价分别是1：2048、1：512、1：1024；12C7、12F8 mAbs能同时特异性识别GST-pORF8、RFP-pORF8融合蛋白，但5C2仅识别GST-pORF8融合蛋白，而不识别RFP-pORF8融合蛋白。结 论 成功获得了3株分泌pORF8 mAbs的细胞株，为研究pORF8质粒蛋白结构和功能及建立特异敏感的沙眼衣原体检测方法奠定了基础。 【关键词】沙眼衣原体；pORF8 质粒蛋白；单克隆抗体 * 【基金项目】国家自然科学基金81102230）；湖南省高校科技创新团队资助项目（湘教通[2010]212号） **【通讯作者】李忠玉，Email: lzhy1023@ 【作者简介】粟盛梅（1971-），女，副教授，主要从事衣原体致病机制研究。 Expression of pORF8 plasmid protein of Chlamydia trachomatis and Preparation, identification of monoclonal antibodies against pORF8 Su Sheng-mei 1, Li Zhong-yu1, Huang Qiu-lin2, Zhong Guang-ming 3, ZHOU Zhou1, LU Chun-xue1 (1. Pathogenic Biology Institute, University of South China, Hengyang 421001, China;2. First Affliated Hospital of University of South China,Hengyang 421001,China. 3. Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Health Science Center at San Antonio,TX 78229 ,USA) 【Abstract】 Objective To express pORF8 plasmid protein of Chlamydia trachomatis and identify the monoclonal antibodies against pORF8 plasmid protein. Methods pORF8 fusion protein was expressed in E.coli XL1 Blue and purified with glutathione-conjugated agarose beads, then the purified protein was used to immunize BALB/c mice，the spleen cells isolated from the immunized mice were fused with SP2/0 myeloma cells to generate monoclonal antibodies against pORF8 protein. Immunofluorescence assay (IFA) was performed to screen the positive hybridoma cells and identify the antibody isotypes. The titer of the mAbs was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). And the specificity was characterized by IF