实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)讲解材料.ppt

质粒DNA酶切（质粒限制性内切酶消化酶切）;背景知识;　　第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 tetr 可以阻止四环素进入细胞。 camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活 hygr 使潮霉素β失活。;第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。;农杆菌复制起始位点;二、限制性内切酶;1) 概念;2) 命名原则;4) 基本特性及用途;;;;Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ① 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。 ② 建立DNA分子的限制酶图谱。 ③ 构建基因文库。 ④ 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。 ⑤ 改建质粒。;5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素;① DNA样品纯度 A）样品杂有RNA 虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段电泳观察。 B）少量的蛋白质污染 对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。 C）样品中杂有其他DNA 如质粒DNA中杂有染色体DNA，虽不影响酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 D）其他杂质 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。;② DNA样品甲基化程度 限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应，则该DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早发???的修饰途径之一， DNA甲基化现象广泛的存在于原核和真核生物中。 如：;③ 酶的星活性 (star activity);6) Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项 　　①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶；加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时酶易产生星活性。 　　②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。 　　③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。 　　④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液；若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。 ;实验目的;实验原理; 限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：　　 ;　则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为：1600bp、2624bp和6325bp的三条DNA 片段;　基因组DNA中由于有较多的EcoR Ⅴ识别位点，因此，经EcoR Ⅴ酶切后产生大小不一的条带，电泳后整个泳道呈现均一的亮带。;实验材料和试剂;实验仪器;;实验注意事项;思考题