蛋白质通性培训讲解.pptVIP

第3章蛋白质的通性、纯化和表征;一、蛋白质的酸碱性质;蛋白质分子和氨基酸分子中可解离基团的pKa值比较;2、蛋白质的等电点;几种蛋白质的等电点; 蛋白质颗粒的直径在1～100nm(＜100nm为真溶液;＞100nm为悬浊液;介于1～100nm的为胶体溶液)之间,因此蛋白质具有胶体溶液的性质;布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜（透析），具有吸附能力;可逆性沉淀：沉淀的蛋白质，内部结构基本上没发生变化，仍保持原有生物学功能，消除沉淀或降低沉淀因素后蛋白质仍会溶解在原来的溶液中。 不可逆沉淀：沉淀出的蛋白质内部结构发生了变化，失去了生物学功能，消除沉淀因素后，不会溶解 盐析法：向Pr溶液加大量高浓度中性盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）能使蛋白质沉淀析出. 任何物质在溶剂中的溶解度都取决于溶质分子间的相对亲和力以及溶质分子与溶剂分子之间的相对亲和力,任何能降低溶质分子相互作用或能增高溶质分子和溶剂分子相互作用的因素都能提高溶质分子的溶解度. 向蛋白质溶液中加入中性盐后会产生两种现象,盐析和盐溶.;盐溶:在盐浓度很稀时,随着盐浓度的增高,球状蛋白质的溶解度增高,这是由于蛋白质分子表面的带电基团吸附盐离子,中性盐离子的水合能力比蛋白质强,吸附盐后,增强了蛋白质与水分子间的相互作用,促进了溶解,同时也降低了蛋白质分子间的静电吸引,使Pr的溶解度升高;不同蛋白质的氨基酸组成不同,分子表面的极性基团数目也不同,结合的水多少也不同,在盐中的溶解度也不同,所以可利用不同蛋白质在不同盐溶液中的溶解度不同,利用不同浓度的盐来沉淀不同的蛋白质。这叫蛋白质的分段盐析。如： 常用的中性盐以硫酸铵最好,硫酸铵盐析能力强,溶解度高,不产生副作用等优点。;2、有机溶剂沉淀法： ★与水互溶的有机溶剂（极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等 ）能使蛋白质在水中的溶解度降低而沉淀析出。 ★有机溶剂能引起蛋白质沉淀主要是因为： 有机溶剂是低介电常数的物质，如在20℃时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4。水的介电常数在20℃时为80，将有机溶剂加入到蛋白质水溶液中，会降低溶液的介电常数，介电常数的降低会增强异性???荷间的吸引力，使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀。 溶质分子间的作用增加会使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，引起蛋白质脱去水化层，促进了蛋白质分子间的聚集和沉淀。 ★用酒精沉淀蛋白质时低温快速沉淀的蛋白质不变性，属可逆沉淀。 ★室温下用酒精沉淀蛋白质属不可逆沉淀。如;3. 重金属盐沉淀法：当溶液的PH＞PI时，Pr颗粒带负电荷，它容易与重金属盐（氯化高汞、硝酸银、醋酸铅等）中的重金属离子（Hg2+、Cu2+、Ag2+）结合成不溶性盐而沉淀。（如：误服重金属盐的病人可口服大量的牛奶或豆浆，然后在服用倾吐剂），此法能使Pr变性。 4. 生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、能沉淀蛋白质的生物碱，称为生物碱试剂以及某些酸（如：三氯乙酸、水杨酸和硝酸）也能沉淀蛋白质。 当PH＜PI时，Pr颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂和某些酸类的酸根负离子生成不溶性盐而沉淀。 ５．蛋白质的相互沉淀作用;反应名称 ;五、蛋白质分离纯化的一般原则;在不同离心场下沉降的细胞组分;2、粗分级分离;3、细分级分离;六、蛋白质分离纯化的方法;（一）透析和超过滤;(二)凝胶过滤（分子排阻层析或凝胶渗透层析）;;3、目前使用的凝胶是交联葡萄糖、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂胶。 交联葡萄糖：是由线型的α-1,6-葡萄糖与1-氯-2,3-环氧丙烷反应而成,商品名为Sephadex 。 聚丙烯酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺共聚而成，商品名为Bio-Gel P。 琼脂糖：是从琼脂中分离制得的，商品名为Sepharose或Bio-Gel A ;4、凝胶过滤的原理：当不同大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随洗脱溶剂在凝胶珠空隙间向下移动，并最先流出柱外，比珠网空小的分子能不同程度自由出入凝胶珠的内外，会被后洗脱下来，这样，由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离;（三）凝胶电泳和等电聚焦;带电颗粒在电场中泳动时,受两种相反方向力的作用;2、影响电泳迁移率的因素;③缓冲液和离子强度，缓冲液的种类直接影响电泳结果，缓冲液的pH直接影响样品的解离程度和电荷密度，距样品pI越远的pH条件下，样品带电荷量越多，泳动速度越快；样品所带的电荷量降低，泳动速度慢。 ④支持介质，介质的结构对样品的泳动速度影响很大，介质对样品的吸附，可导致样品拖尾，降低分辨率，纸的吸附作用大，醋酸纤维素薄膜吸附作用小。有的介质（如淀粉胶和纸）具有较