1基因工程 1 (生理 一复习课程.ppt

常用的启动子 植物的35S，ACTIN的启动子，Ubiquitin启动子等 本身基因的启动子 在植物中一般选该基因ATG向前1-2Kbp 核苷酸认为是该基因的启动子 亚克隆过程 通过电转的方法，将穿梭质粒导入到农杆菌中，再次PCR验证 1.9 如何将农杆菌导入到植物中 拟南芥一般通过 花粉管 DIP方法 转化效率相对较低 最多0.5% 水稻和油菜通过组织培养的方法 其他方法基因枪法(小麦和大麦，水稻等)，原生质体法（利用PEG）等 植物抗性筛选中的常用抗性标记 Bar,HTP 潮霉素,NEO新霉素（kan）,GENT 庆大霉素等， 主要根据你的载体选择 植物基因工程中的定位（报告)基因 编码产物能够被快速测定，常用于判断外源基因能够成功地导入体细胞，是否启动表达的一类特殊基因 GUS,GFP 2.0如何验证基因转到植物中（一） 表现型 抗性筛选 DNA 层次验证 PCR 筛选，提取植物DNA，通过特定引物筛选 SOUTHERN 杂交 如何证明该基因是否表达水平及表达差异 RT-PCR RNA-cDNA-PCR Real-time PCR 或者半定量PCR验证表达水平 Northern 杂交 在RNA层次上证明表达 蛋白质水平 Western 杂交 至少5 LINE以上的植物表现型一样才可以确定该基因的功能 2.1 如何突变某一个基因 通过筛选已有的突变株获得（T-DNA插入或者点突变），已经有拟南芥和水稻的突变株库 通过构建RNAi突变载体,敲除特定基因 这种短片断双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA 同样也需要检测RNA水平等确认 同一个目的基因的片段，大概在20-40个核苷酸，正反方向扩增，放到内含子两侧 内含子 研究基因的序列已经知道 HAP3b的核苷酸序列已经在数据库中存在，已有的研究推测该基因可能和植物开花有关，现在要验证该基因在植物开花中的作用。 实验设计：将该基因导入到植物中并过表达该基因看转基因植物的表现型来验证该基因的功能。 获取目的基因现在基本是通过PCR的方法获得。 如何通过PCR方法获得目的基因 什么是PCR技术 利用DNA聚合酶对特定基因做试管内?(In?Vitro)?的大量合成 PCR技术需要哪些条件 PCR仪 就是一个可以自动控温的 水浴锅 PCR反应的条件 缓冲液，Taq酶，需要扩增的目的基因模板，引物，dNTP. 其中缓冲液，酶，dNTP均有公司直接提供。 基因模板从何而来（一般可以从植物基因组DNA或者提取植物RNA，反转录成cDNA作为模板） 一般PCR反应的体积在20ul-100ul之间 引物如何设计 学习如何使用DNA*软件 软件如何获得：互联网 PCR反应设计流程 模板DNA的变性 93-95度 模板DNA与引物的退火(复性) 55-65度 引物的延伸 72度 一般1分钟1KB 计算延伸时间 一般循环为25-35 个 PCR 动画 /v_show/id_XMTY1ODg4Nzgw.html PCR跑完了干什么？ DNA 电泳 什么是DNA 电泳 目的DNA片段的分离 两种电泳 （1） 聚丙烯酰胺凝胶电泳??适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。  （2） 琼脂糖凝胶电泳??可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。一般我们用1%的浓度。电泳结果 用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察或者凝胶扫描系统拍照，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。 电泳原理 DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。 DNA片段跑的快慢和什么有关？ ⑴DNA分子大小??DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 ⑵DNA分子构型??对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。 一张普通的电泳图 注意 在基因克隆中的PCR和普通的PCR的差异 用高保真TAQ酶 一般用cD