1重组DNA技术讲解.ppt

重组DNA技术 RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY;;;;;;;;;;;基因重组 ——是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 广泛的分为三个水平： 整体水平（如 生物有性杂交） 细胞水平（如 单克隆抗体技术） 分子水平（如 构建重组体）;重组DNA技术相关概念 ;技术水平：分子克隆(即DNA 克隆 ) 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;第 一 节 常用工具酶; 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱性磷酸酶 反转录酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE); Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 基因工程技术中常用Ⅱ型， 特点是识别位点与切割位点一致;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatible end)。;切割会受其他因素的影响 限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。 例如，EcoR I在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油浓度大于5%（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活性（star activity），以EcoR I*表示。;：催化两个相邻的3′-OH和5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。;在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;可用32P标记的ATP特异地标记多核苷酸的5′末端。 ;碱性磷酸酶;第二节 目的DNA的获取;目的基因;目的基因的获取;* 化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;;基因组DNA文库（genomic DNA library） 将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库;cDNA文库(cDNA library)： 以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。;; 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 ;第三节 重组DNA技术中的DNA载体 DNA Vectors in Recombinant DNA Technology ;载体（vector）是为携带感兴趣的外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子 ;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达??体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录和翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;一、克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖;1. 质粒 (plasmid);pUC系列质粒图谱;λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用于cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用于基因组DNA克隆） cos位点:λ噬菌体DNA为线性双链分子，两端各有一条由12个碱基组成、彼此完全互补且5′单链突出的序列（即粘性末端），称cos位点 ;3. 穿梭载体（shuttle vector） ;