20101014-第5讲基因工程 -操作教学教材.ppt

基因工程 第四节 基本操作过程; 供体 + 载体 重组体 受体 工程细胞;一、分离：提取、制备目的基因和载体DNA;3.目的基因的用途： 理论上 ① 研究基因结构、功能及调控； ② 研究生物进化及相关同源性； ③ 与正常基因比较，查出异常， 确定疾病基因。;? 从生物基因组中分离目的基因 原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。 真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。 ? 从mRNA获得目的基因 从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因，也可通过cDNA文库的方法获得目的基因。 ? 其他方法（见后）;（二）构建DNA文库; 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。; 提取基因组DNA，采用限制酶将基因组DNA切割成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都转化宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的集合体，这样一个集合体称为基因组文库。这种保存了该种生物所有遗传信息文本，就如图书馆，用时随时抽取。通过杂交筛选获得特定的基因片段。;基因文库的构建图; 理想的基因组文库中 所有克隆DNA片段的总和应为整个基因组的DNA序列。 克隆与克隆之间应有重叠序列。 ; 个体的所有细胞均具有相同的基因组结构，但在同一机体不同类型的细胞或同一细胞在生长发育的不同阶段，以及受到不同因素（物理、化学或生物因素）的刺激，基因表达的种类与数量是不同的。; cDNA文库是某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆。只有在细胞内存在mRNA，才能建成相应的cDNA文库，所以不同种类及不同状态的细胞有不同的cDNA文库。;构建cDNA文库前，必须先从细胞中提取高质量的mRNA。 因mRNA有poly（A）尾巴，可用12～18寡聚d（T）片段作为引物，加入4种dNTP， AMV（或MMLV）逆转录酶催化第一股链的合成。 ;用RNase H去掉 mRNA，剩下的单链DNA的3′端往往有自发回折（原因不明）形成的发夹结构，正好可以作为合成第二条DNA链的引物。 由T4DNA聚合酶催化第二股链的合成，即得到??链cDNA的混合体。 采用SI核酸酶处理，可得到平端的双链cDNA，然后再与载体进行连接。;将cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA。 将得到的所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的集合体，这样一个集合体就称为cDNA文库（cDNA library）。 完成DNA重组后可通过杂交筛选获得特定的cDNA克隆。 ; cDNA克隆的制作过程;基因组DNA文库和cDNA文库的构建; （三）制备目的基因的方法 1.从文库中提取 在已建立的基因组文库、cDNA文库中取得目的基因的克隆，提取DNA，经限制酶切下，插入到相关载体。;; （2）从基因组DNA直接切取 对一些相对小的基因组，其物理图谱已经确定，背景资料清楚的原核生物、病毒等基因组，可直接用限制酶消化后，电泳分离获得目的基因片段。可以从其它已克隆的质粒上用限制酶切下，再插入到有关载体上。;（3）用PCR技术体外扩增有关DNA片段 用PCR技术可以在体外有效而且特异地扩增目的基因片段。在已知序列的前提下，可以采用RT-PCR方法直接从mRNA获得特定基因的cDNA。也可从已有的cDNA克隆中扩增出编码区的DNA片段，用于构建表达载体。因为PCR有一定错配率，必须用测序予以确认。; （4）化学合成 ;（四）载体的选择和制备; 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。; 无论选用何种载体，首先都要获得载体分子，即分离纯化λ噬菌体DNA或制备粘性质粒和其它有关质粒。获得载体后，采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得线性分子，以便于与目的基因片段进行连接。;二、酶切; 三、连接; 1.粘性末端连接 大多数限制酶错位切断DNA分子，产生5′或3′粘性末端，如果用同一种酶消化载体和目的DNA分子，或者载体DNA和目的DNA虽然用不同的酶处理，但能产生相同的粘性末端，那么DNA片段之间很容易按照碱基配对关系退火，互补的碱基以氢键相结合。在T4 DNA连接酶的作用下，其末端以磷酸二酯键相连接，成为环状DNA重组体。;