基因工程 体外重组 (带动画)知识讲稿教程文件.pptx

基因工程第六章 DNA重组的操作1.克隆载体2.表达载体转化或转导电穿孔或显微注射真核细胞受体细胞原核细胞表达扩增或表达1.基因文库2.PCR3.基因差异表达外源DNA载体DNA？连接重组分子第一节 DNA的体外重组限制酶—分子剪刀限制酶—分子剪刀连接酶—分子胶水粘性末端连接效率最高！重组DNA分子 1、粘性末端的连接 　黏性末端黏性末端第一节 DNA的体外重组1. 粘性末端连接创造互补粘性末端的方法有哪些？同种酶同尾酶第一节 DNA的体外重组　碱性磷酸酶：去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。注意：目的基因正反向插入；载体与多个目的基因片段重组。3412143432第一节 DNA的体外重组　（2）两端具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接　两种不同的限制性内切酶 两端会产生非互补的突出端 定向重组体EcoRIHindIIIEcoRI　对基因酶切HindIII对载体酶切HindIIIEcoRI第一节 DNA的体外重组碱性磷酸酶？避免了目的基因正反向插入质粒载体的定向重组第一节 DNA的体外重组2. 平头末端连接第一节 DNA的体外重组平末端　　　平末端SmaI限制酶（1） 直接连接　 T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。　第一节 DNA的体外重组　（2） 人工加尾形成 “粘性末端” a）同聚加尾 法 DNA末端转移酶 DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸, 利用DNA末端转移酶分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。　第一节 DNA的体外重组 a）同聚加尾法 非酶切位点缺点：不能把插入片段再切下来。第一节 DNA的体外重组还有哪些方法能够创造粘性末端？第一节 DNA的体外重组b）衔接物(linker)连接　Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。　GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker：第一节 DNA的体外重组衔接物(linker)连接第一节 DNA的体外重组衔接物(linker)连接优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker 缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段第一节 DNA的体外重组c) DNA接头 (adapter)连接法 adapter:一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’ BamHI adapter第一节 DNA的体外重组DNA接头 (adapter)连接法缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。防止自我连接：先用碱性磷酸酶（CIP）处理接头以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。小结平头末端连接（1） 直接连接（2） 人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾法 b)衔接物连接 c) DNA接头连接法PCR?第一节 重组DNA分子的构建　3.PCR产物的连接　（1）在引物的5’端设计酶切位点引物互补序列GCAGAATTC 3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列（5’端多余的3~5bp属保护碱基）第一节 DNA的体外重组3’ 模板模板-3’ 互补序列引物15’-　GCAGAATTC EcoRI位点复性3’ 模板互补序列5’-GCAGAATTC -3’ 延伸3’ 模板互补序列 PCR产物-3’ GCAGAATTC 5’-第一节 DNA的体外重组模板3’ 模板3’ 引物2互补序列-5’ GCTAGCCGG 3-’ BamH I 位点复性模板3’ 互补序列GCTAGCCGG 3’-延伸模板3’ PCR产物 互补序列GCTAGCCGG BamH IEcoRI对载体酶切BamH IEcoRI第一节 DNA的体外重组PCREcoRIBamH I质粒载体的定向重组第一节 DNA的体外重组Taq DNA聚合酶　（2）与T载体直接连接　Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）,因此PCR产物两个3’端一般都有一个A　T载体的两个3’端人为地各加一个T：利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！第一节 DNA的体外重组T载体图第一节 DNA的体外重组PCR产物载体dTTPdNTPTaq DNA聚合酶ATAT　3. PCR产物的连接　（2）与T载体直接连接T AT A第一节 DNA的体外重组1.粘性末端连接（1）两端具有相同粘末端的DNA分子之间的连接（2）两端具有不同粘性末端的