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载体构建 戎浩 2015.12CONTENTS目录 载体简介1 载体构建2 注意事项3 常见问题4目的基因的克隆与鉴定生理检测载体构建纯化大肠转化，质粒提取与鉴定移栽分子检测继代繁殖农杆菌的转化与活化筛选外植体制备浸 染共培养1.载体简介 1.1载体 载体（vector） ，能将外源DNA或基因片段携带入宿主细胞内的一个具有自我复制能力的DNA分子。1.2载体的分类质粒载体 质粒载体是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。1.2载体的分类噬菌体载体 利用噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。1.2载体的分类病毒载体 感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。 现在人们还在不断寻找新的载体，如叶绿体或线粒体DNA也有可能成为载体。1.2载体的分类 克隆载体 中间载体 卸甲载体 植物基因工程载体一元表达载体表达载体双元表达载体1.2载体分类中间载体1.2载体分类卸甲载体 野生型的Ti质粒不能直接作为基因工程的载体，期T-DNA区存在一段阻碍细胞分化和植株再生的基因Onc，将其切除，即“解除”其“武装”，因此称为卸甲载体。1.2载体分类双元表达载体 一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP，GUS或抗性基因蛋白）的普通表达载体。另一个载体就是双元表达载体。1.2载体的功能运送外源基因高效的转入到受体细胞中为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供条件1.3载体应具备的条件具有对受体细胞的可转移性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的酶切位点具有合适的选择性标记2.载体构建（酶切连接）目的基因获得酶切连接引物设计质粒提取大肠杆菌转化目的片段扩增大肠杆菌转化农杆菌转化PCR产物纯化TA克隆 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。2.1目的基因的获得从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。2.2引物设计（合适的酶切位点）2.3 PCR 为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶进行目的片段的扩增。（加尾）2.4 PCR产物纯化目的片段琼脂糖凝胶电泳切胶回收（方法参照试剂盒）1.避免一些非特性条带2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响2.5 TA克隆 聚合酶链反应产物的克隆载体，线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与T载体（pMD19）之间的A-T互补，因此称为TA克隆。 体系： T载体0.5 μL 目的片段 4.5 μL Solution I 5.0 μL2.6 大肠杆菌转化 16℃，8h2.7 质粒提取2.8 酶切37℃，2h体系：限制性核酸内切酶2.5 μL 10 × buffer 5.0 μL 质粒20 μL ddH2O to 50 μL 对pMD19-目的基因和表达载体（如PSB130）分别进行酶切2.9 连接16℃，8h2.10 大肠肝转化2.11 农杆菌转化体系：T4连接酶0.5 μL T4 buffer 1.0 μL 表达载体1.0 μL 目的片段7.5 μL3.载体构建（同源重组）目的基因获得LR反应大肠杆菌转化引物设计质粒提取农杆菌转化目的片段扩增大肠杆菌转化PCR产物纯化BP反应3.1目的基因的获得从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。3.2引物设计加attB的接头，对读码框3.3 PCR 为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶进行目的片段的扩增。（加尾）3.4 PCR产物纯化目的片段琼脂糖凝胶电泳切胶回收（方法参照试剂盒）1.避免一些非特性条带2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响3.5 BP反应3.6 大肠杆菌转化 3.7 质粒提取3.8 LR反应3.9 大肠杆菌转化3.10 农杆菌转化4.注意事项PCR产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验；在细胞转化时，冰浴和热激要严