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第十章 基因工程基本原理简介 第三节 基因工程中的通用技术 第五节 基因工程中的最新技术 图8 DD-frag -3（上）、DD-frag-5（A）与DD-frag-6（B） 点杂交鉴定结果 1．阳性对照 2. 阴性对照 3. 家蝇基因组 1．阴性对照; 2. 家蝇基因组; 3．转基因处理组; 4. 对照组 三、重组质粒的构建与鉴定 1. 工具酶：限制性内切酶、连接酶、聚合酶及其他修饰酶等； 2. 大肠杆菌感受态细胞； 3. DNA的酶切与回收； 图. pIRES-EGFP 4. 目的片段与载体的连接； 5. 转化与重组质粒的鉴定； 1）初步鉴定：α-互补；快速鉴定；原位杂交；PCR；抗性筛选； 2）酶切鉴定； 3）测序鉴定。 * 本章的重点内容： 1. 什么是基因工程？ 2. 获得目的基因的方法有哪些？ 3. 如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？ 4. 基因工程中的最新技术。 第一节 基因工程原理简介 一、基因工程的定义 本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因/DNA片段的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。 广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。 目的基因获得 表达载体构建 基因的导入 表达的鉴定 核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。 原核:包涵体,分泌型 真核: 文库 合成 PCR 基因组文库cDNA文库 细菌：氯化钙；电穿孔; 细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V; 动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V； 载体 质粒(plasmid) 粘粒(cosmid) λ噬菌体(λ) 第二节 基因工程的基本步骤和方法 一、核酸的提取纯化与定量 包括RNA、 DNA及plasmid DNA的提取纯化技术 二、核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS 2000 1000 750 100 200 1 DL2000 marker 2 BamH1和EcoRI双切 3 BamH1单切 4 HindⅢ单切 5 重组质粒pVAX1/ABPS1 1 2 3 4 5 三、核酸探针（probe） 1. 原理； 2. 标记物； 3. 种类； 4. 应用 Dot blot、Southern blot： DNA、Northern blot： RNA 四、Western blot: Protein 一、获得目的基因的方法 基因文库（cDNA文库和基因组文库），化学合 成，PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技 术。 （一）基因组文库 目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组 基因或调控序列的克隆等。 第四节 基因工程中的常用技术 家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因启动子克隆与初步应用研究 Cloning and initial application of functional promoter of Musca domestica yolk protein gene 启动子克隆一般思路 启动子区 杂交 增强子 调控启动子 核心启动子 基因 3’ 5’ 转录起始点 探针 +50 -40 ATG -4000 -500 功能 分析 克隆启动子 实验一、家蝇部分基因组文库的构建 1 材料与方法 1.1 家蝇基因组DNA的提取 2.1 基因组DNA的部分酶切 3.1 EMBL3载体臂的制备 4.1 连接与包装 5.1 基因组文库鉴定 Bcl I随机酶切 左臂 基因组DNA 右臂 left arm（20kb） central stuff 14kb r