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动物细胞工程教学课件 甘肃农业大学 生命科学技术学院 第三部分 动物胚胎工程 第二章 动物体外受精技术 In vitro fertilization §1 概述 一、概念 是指精子和卵子在体外模拟体内的生殖道环境中完成受精过程的技术。它的基本原理是在人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、pH等），使卵丘卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精。 由于卵子和精子的受精过程是在实验室中完成，故通过这一技术而产下的动物又称为“试管动物”，如“试管牛”、“试管猪”、“试管婴儿”等。 该技术包括以下几个技术环节： 卵母细胞体外成熟培养（IVM）、体外受精（IVF）和受精卵体外早期培养（IVC） 试管动物技术——体外受精 卵子 精子 体外 受精卵 早期胚胎 移植 产生后代 1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。 1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，并产下15只健康仔兔。这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。 目前，采用IVF-ET技术，每对废弃的牛卵巢可获得3头左右的犊牛。为充分利用良种母牛的遗传资源，20世纪80年代后期，牛的活体取卵技术（Ovum pick UP.OPU）发展迅速。活体取卵和IVF-ET结合已成为欧、美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群选择的重要繁殖技术。 牛的体外受精技术不仅应用于畜牧生产，同时，也成为研究其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段。 体外受精技术的发展简史 三、存在的问题和发展方向 1、存在的问题 １）囊胚发育率低，细胞数少。 ２）产仔率低，胎儿初生重高。 2、发展的方向 １）深入研究卵母细胞成熟和胚胎发育的分子机理； ２）加强腔前卵泡的培养研究，充分利用优良母畜的遗传资源； ３）加强体外受精与其他生物技术的结合。 四、意义 1、研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。 2、在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。 3、在人类，IVF技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。 4、体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。  §2 卵母细胞的体外成熟 一、卵母细胞的获取 在卵母细胞获取技术中，卵泡发育的募集、选择和优势化，是人工超数排卵和卵母细胞体外成熟的重要基础。 卵巢中含有大量的小卵泡，但在每个发情周期中只有部分卵泡能够接受FSH/LH的作用开始发育，这一现象称为募集。 由于促性腺激素的作用，使卵泡细胞雌激素的合成和分泌增加，雌激素通过负反馈作用于下丘脑，控制脑垂体减少FSH的分泌，使其他小卵泡无法接受促性腺激素的作用，结果使卵泡发育闭锁，这一现象称为选择。 卵泡发育到最后阶段，只有少数几个或一个优势卵泡继续发育，这一现象称为优势化。 由于雌激素的负反馈作用，促卵泡素水平继续下降，而促黄体素分泌增高，在发情周期的中期促黄体素量达到峰值而激发排卵。卵泡排出卵子后，将发育成黄体，分泌孕酮和少量雌激素，这些激素反馈作用于下丘脑，抑制脑垂体分泌促卵泡素和促黄体素，从而抑制卵泡的发育。 卵母细胞体外成熟培养时，在培养液中加入促卵泡素活PMSG\hCG，能显著提高卵母细胞体外成熟率。 1、离体卵巢采卵：是从屠宰母畜的卵巢采集卵母细胞。 （1）卵泡抽吸法：用注射器针头从卵泡远端抽吸卵泡液。 （2）卵巢解剖法（切割法、剥离法）：用手术刀或剪划破卵巢，再悬浮、消化获取卵母细胞。 对卵泡卵母细胞一般采用机械分离法和酶消化法相结合，既克服了机械分离时间长和对卵母细胞机械损伤的缺点，又减轻了酶消化过程中对细胞细微结构的破坏。 2、活体采卵：是从活母畜的卵巢采集卵母细胞。 B超引导法：借助超声波(B超)探头和屏幕的引导，从活母畜卵巢采集卵母细胞。即利用真空泵的负压将卵母细胞及卵泡液吸入离心管。 保定母畜、全