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IHC 和ICC 中的疑难解析以及对照的设置 一、未染色 1. 一抗和二抗不匹配 使用的二抗来源要与一抗的来源不同（比如：一抗是打在兔子中的，收取到的一抗是兔 源的，那么二抗要是抗兔的），确保一抗和二抗的同种型是可兼容的（IgY vs IgG）。 2. 一抗相对于目标蛋白的浓度不够 加大抗体浓度，在4°C 延长孵育时间，可以过夜。 3. 抗体可能由于其抗原的结构（3D 形式）不适合用于免疫组化实验  检查抗体的说明书看其是否适合用于免疫组化实验，以及什么类型的免疫组化实验（如 甲醛/多聚甲醛的固定，冰冻切片等等）  在非变性蛋白免疫印迹实验中检测抗体，以确保它没有受到损坏。 4. 一抗二抗可能由于不正确的储存方式、不正确的稀释方法、经常反复冻融而失去活性 设置阳性对照以确保一抗和二抗是可以使用的。（关于设置对照更多信息查看第4 部分） 5. 在检测的组织中并没有该蛋白的表达 根据抗体公司的推荐，设置阳性对照。（关于设置对照更多信息查看第4 部分） 6. 在组织中检测的目标蛋白表达量低 放大信号，例如：使用生物素偶联的二抗和偶联的链霉素。 7. 如果你的检测系统是免疫荧光的话，二抗需要避光储存 要避免二抗暴露于光下 8. 脱蜡不彻底 延长脱蜡时间 （但不超过20 分钟），且使用新鲜的二甲苯 9. 固定步骤中使用甲醛和多聚甲醛为固定液时，可能会隐藏抗体识别的抗原表位。  使用不同的抗原修复方法来暴露抗原表位（用 PH6.0 或 PH9.0 的缓冲溶液加热处理， 或者酶法等等）  缩短固定切片的时间 10. 蛋白位于细胞核中，抗体不能很好的渗入核内 添加如Triton X 的强的通透试剂到封闭液、稀释抗体的溶液中。可查看关于通透的具体 指南。 11. PBS 缓冲液被细菌污染，损坏了目的蛋白的磷酸基团 向含抗体的PBS 储存液中加入0.01%的叠氮化钠，或者使用新鲜无菌的PBS。 二、背景深 1. 非特异性结合位点封闭不彻底  延长封闭时间，或者考虑更换封闭液。Abcam 推荐10%的血清封闭1h 或者1-5%BSA 封闭30 分钟。  另一种方法是选择被处理的去除和样品同种的Ig 的二抗。 2. 一抗浓度过高 梯度稀释抗体，选择最佳的浓度，4°C 孵育时可进一步稀释抗体（使抗体缓慢和抗原结 合最佳） 3. 孵育温度过高 4°C 孵育 （过夜） 4. 二抗非特异性结合  设置没有添加一抗的二抗对照  如果只有二抗的情况下仍然染色了，可以考虑更换二抗或者使用被处理的去除和样品同 种的Ig 的二抗。 5. 组织清洗时不彻底，仍然残留固定液 在每一步骤间用PBS 洗脱时都要彻底 6. 存在有活性的内源性过氧化物酶 使用酶抑制剂，对于碱性磷酸酶使用 2mM 的左旋咪唑，对于过氧化物酶使用 0.3%的 H O 。 2 2 7. 如果你的检测系统是免疫荧光的话，使用甲醛或者多聚甲醛为固定液的固定过程可能会 引起自发荧光。  在绿色光谱下，甲醛/多聚甲醛会产生自发荧光，因此可以尝试使用红色光谱的荧光素。  如果有红光检测系统的话，可以使用发红光的荧光素。 8. 显色过长（放大技术） 缩短显影时间，稀释二抗或者稀释显色盒。 9. 使用过多底物（酶检测） 稀释底物，降低底物孵育时间。 10. 发色体与细胞或组织中存在的PBS 反应（酶检测） 孵育底物前使用Tris 溶液清洗切片，然后再用Tris 溶液清洗切片。 11. 通透时损坏了膜，破坏了膜蛋白。 使用温和点的去垢剂（如用Tween ，而不是Triton），或者在溶液中不添加去垢剂成分。 可以查看通透指南。 三、非特异性染色 1. 一抗二抗浓度过高 降低抗体浓度，缩短孵育时间。可以与不表达目标蛋白的细胞或者组织对比信号的强弱。 2. 存在有活性的内源性过氧化物酶 使用酶抑制剂，对于碱性磷酸酶使用 2mM 的左旋咪唑，对于过氧化物酶使用 0.3%的 H O 。 2 2 3. 一抗来源同染色的组织来源相同（比如鼠源的一抗打到鼠中获得的）。当二抗使用时， 它就会结合到那个来源的所有组织。 使用一抗的来源要不同于你的组织。使用生物素偶联的一抗和偶联链霉素的检测系统。 4. 切片/细胞干燥 保持切片/细胞湿润，勿使其干燥。 四、设置对照 阳性对照 1. 设置