流式细胞仪操作技巧.pptVIP

应用流式细胞术基本程序和数据分析 流式细胞仪仪器结构 液流系统 光学系统 激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统 FCM对照设置 阳性对照 阴性对照 空白对照 同型阴性对照：是指与单克隆抗体相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光标记法染色，同型对照也应标记荧光素。它包含了自发荧光、Fc受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。 5. 正常对照 4 数据定性、定量分析 * * 流式细胞仪的主要技术指标 1. 荧光测量灵敏度 2. 仪器的分辨率 3. 前向角散射光检测灵敏度 4. FCM分析速度分析速度以每秒可分析的细胞 数来表示 5. FCM分选指标主要包括：分选速度、分选纯 度及分选收获率。 　　 流式细胞仪可测量的主要参数 细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 影响信号定量分析的因素 细胞的荧光染色：细胞对荧光染料分子的亲合性相对一致、细胞结合的荧光分子量、染色的浓度、时间、温度、pH值、细胞数等。 激光光源的稳定性。 细胞流速的稳定性。 细胞悬液样品的质量：细胞粘连、重叠、杂质过多等。 应用流式细胞术的基本步骤 首先制备出合格的单细胞悬液。 对感兴趣的细胞生物化学成分进行特殊染色。 上机测量，采集数据。 对收集、储存的数据进行定性、定量分析。 从生物医学方面对分析结果予以解释。 制备合格的单细胞悬液 标本来源：骨髓、外周血、脑脊液 或淋巴组织穿刺及活检组织。 处理：肝素抗凝，不超过48小时，检测前常规记数和形态学检查。目前一般都直接用全血标记，近可能减少冷冻、离心等有可能损伤细胞的步骤。组织标本研磨后必须过滤。 标 记 和 检 测 根据临床初步印象或研究目的，选择检测哪些指标？ 选择抗体 选择荧光素 标记 上机检测获得最佳结果 各系列正常造血细胞表达的主要相关抗原：T淋巴细胞系：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8；B淋巴细胞系：CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、  CD79、FMC-7；粒、单核细胞系：CD11，CD13，CD14，CD15，CD33、  CD64、CD65w、CD117及MPO；巨核细胞系：CD41、CD42、CD61、CD62；红细胞系：CD71、血型糖蛋白（Glycophorin）；其它：造血干祖细胞共同抗原CD34、CD38、CD95及末端  脱氧核糖核苷酸转换酶（TdT），人类主要组织  相容性抗原HLA-DR，白细胞共同抗原CD45等。 指标选择 安徽省立医院急性白血病免疫分型 抗原选择方案? 临床提示急性白血病、骨髓增生异常综合症（MDS）转化型、慢粒（CML）急性变时，首先用三色荧光标记法测CyMPO/CyCD79a/CyCD3，然后根据初筛结果，侧重某一系列的抗原表达特征，进行第二次抗体选择，具体方法如下：? CyMPO+CyCD79a-CyCD3-时，选CD34/CD45，CD13/CD19，CD33/CD7，HLA-DR/CD10，最后根据情况考虑是否补测CD14，CD11b 2 CyMPO-CyCD79a+CyCD3-时，选CD34/CD45，CD13/CD19，CD33/CD7，CD10/CD20，如条件和时间允许，最好补测SIgM，Cyμ（IgM重链） CyMPO-CyCD79a-CyCD3+时，选CD34/CD45，CD13/CD19，CD33/CD7，加CD3/CD4/CD8，最后根据情况考虑是否加测CD2/CD10，CD56 CyMPOCyCD79aCyCD3均阴性时，选CD34/CD45，CD13/CD19，CD33/CD7， CD71，CD41，最后根据情况考虑是否补测CD38，CD10，CD56， CyMPO、CyCD79a、CyCD3中有两项同时阳性时，除CD34/CD45外，选与两个阳性指标所代表的相应系列有关的抗体组合，如CD34/CD45，CD13/CD19，CD33/CD7，HLA-DR/CD10 抗体选择 可靠公司来源 抗体的克隆号和亚型，不同的抗体克 隆在流式应用的效果不一样 种属差异 抗体滴度与抗原抗体反应量 是否需要对照？ 已有的激光器