ets2对食管鳞癌细胞生长 侵袭及mtorp70s6k分子信号调控作用 word格式.docxVIP

研究Ets2 表达下降对食管鳞癌细胞生物学行为的影响，初步探讨Ets2在食管鳞癌发生发展中的作用。本课题主要分为两部分：第一部分：检测转录因子Ets2 在食管鳞癌细胞株EC1、Eca109、EC9706 中的蛋白表达情况。第二部分：研究转录因子Ets2 在食管鳞癌发生发展中的作用。通过靶向特异性的siRNA阻断Ets2 基因表达，检测Ets2 表达下调对食管鳞癌细胞株增殖、侵袭、周期和凋亡的影响，并检测mTOR-p70S6K 信号通路主要蛋白的表达情况，初步研究Ets2 基因在食管鳞癌细胞中的生物学效应及作用机制。方法：1.食管鳞癌细胞中转录因子Ets2的表达情况利用Westernblot技术从蛋白水平检测转录因子Ets2在正常食管上皮细胞Het-1A和食管鳞癌细胞株EC1、Eca109、EC9706 中的表达。2.转录因子Ets2对食管鳞癌调控作用的初步探索体外化学合成3 对针对Ets2 基因mRNA的特异性siRNA，采用脂质体法转染食管鳞癌细胞株，通过Real-timePCR和Westernblot筛选效率最高的siRNA 片段。利用筛选到的siRNA转染食管鳞癌细胞，以转染非特异性siRNA的细胞、未转染siRNA的细胞及只加入了转染试剂的细胞作为对照，采用EdU荧光标记法和CCK-8 法检测食管鳞癌细胞增殖率和细胞存活率的变化；利用AnnexinV-FITC/PI 双染法及caspase-3 的蛋白水平表达情况分析细胞凋亡的变化；流式细胞仪检测食管鳞癌细胞周期的变化；Transwell小室法检测食管鳞癌细胞侵袭能力的变化，Westernblot检测E-cadherin 的表达情况来反应食管鳞癌细胞粘附能力的变化；通过Westernblot检测mTOR/p70S6K途径主要蛋白的表达水平变化。结果：II1.食管鳞癌细胞中转录因子Ets2的表达情况Western blot 结果显示，转录因子Ets2 在正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞株中均有表达，与正常食管上皮细胞Het-1A相比，Ets2 在食管鳞癌细胞EC1、Eca109和EC9706 中的蛋白表达量均明显升高，尤其在EC9706 细胞中增加最为显著，因此采用EC9706细胞筛选siRNA干扰片段。2.转录因子Ets2对食管鳞癌调控作用的初步探索3 对Ets2 基因的特异性siRNA干扰片段中，Ets2siRNA1 在转染48h 后，转录水平和蛋白水平的沉默效果相对较好，因此选用Ets2 siRNA1 片段转染食管鳞癌细胞系EC1、Eca109、EC9706 进行后续实验。与对照组相比，靶向siRNA 下调Ets2 基因表达后，可以明显地抑制食管鳞癌细胞的增殖；Ets2siRNA 组的食管鳞癌细胞的早期凋亡比例上升，凋亡蛋白caspase-3的蛋白水平表达增多，说明下调Ets2 基因能够促进细胞凋亡；Ets2 表达下调的食管鳞癌细胞Eca109、EC1的G0/G1期细胞明显增加；减弱食管鳞癌细胞侵袭能力，且E-cadherin的蛋白表达上升说明食管鳞癌细胞的粘附能力增强；此外，Westernblot检测显示Ets2 siRNA组mTOR/p70S6K信号通路中的关键蛋白p-mTOR和p-p70S6K的表达量明显下降。结论：1.转录因子Ets2在三株食管鳞癌细胞中均呈高表达；2. 靶向siRNA下调Ets2 表达后，食管鳞癌细胞的增殖能力减弱，促进细胞凋亡，细胞周期被阻滞在G0/G1期，细胞的侵袭能力减弱，说明转录因子Ets2 表达下调能够有效抑制食管鳞癌细胞生长和侵袭；3. Ets2 表达下调的食管鳞癌细胞株中，mTOR/p70S6K 中关键因子表达量明显下调，初步推测Ets2可能通过mTOR/p70S6K信号通路在食管鳞癌发生发展中发挥作用。关键词：Ets2；食管鳞癌；siRNA；生长；侵袭；mTOR/p70S6KIIITheregulationofEts2ongrowth,invasionandmTOR/p70S6KmolecularsignalofesophagealsquamouscancercellsAbstractEsophageal cancer (EC)，which is oneof themost common lethal malignancies，isadiseaseofesophagealepithelialandesophagealmucosa.Therearetwomajor histologictypesofEC:esophagealadenocarcinoma(EAC)andesophagealsquamous cell carcinoma (ESCC). The two histologic types of EC are diff