fasfasl途径在氟致shsy5y细胞凋亡中的作用 word格式.docxVIP

缩 略 词Blue-Bromo-phenol溴酚蓝CH11Fas 受体激动剂DD死亡结构域DED死亡效应区dd H2O三蒸水DEPC焦碳酸二乙酯DISC死亡诱导信号复合体DMSO二甲基亚砜EB溴化乙锭EDTA-Na乙二胺四乙酸钠FADD衔接蛋白FBS胎牛血清FCM流式细胞术kD千道尔顿（分子量单位）MTT噻唑蓝NGFR神经生长因子受体NMPA正常熔点琼脂糖PBS磷酸盐缓冲液PCD程序性细胞死亡PI碘化吡啶Rnase A核糖核酸酶 ART-PCR逆转录聚合酶链式反应SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞TNFR肿瘤坏死因子受体TNF肿瘤坏死因子Tris三羟甲基氨基甲烷ZB4Fas 受体拮抗剂Fas/FasL 途径在氟致 SH-SY5Y 细胞凋亡中的作用1徐八一 导师：王爱国教授摘要地方性氟中毒是一种严重危害人体健康的全身性疾病。人群调查发现高氟地区儿 童智力发育受阻。动物实验结果证实氟可通过血脑屏障在脑组织蓄积，从而诱导神经 细胞凋亡和学习与记忆能力的降低，并认为神经细胞凋亡在氟致神经毒性中起重要作 用。但过量氟如何诱导神经细胞凋亡的机制目前研究较少。细胞凋亡是由基因控制的程序化细胞死亡，对于机体稳态的维持、某些疾病的发 生与发展、神经系统的正常发育以及机体对环境因素刺激的应答等方面具有重要意 义。细胞凋亡功能亢进与组织损伤和器官功能衰竭的发病密切相关。目前介导细胞凋 亡的信号转导途径主要有 Fas/FasL 途径、线粒体途径和颗粒酶 B 途径等。已有的研究 表明：氟可诱导多种细胞凋亡；氟中毒人群半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（Caspase）基 因表达升高；破骨细胞中 Fas（Factor associated suicide, Fas）受体和 FasL（Fas Ligand） 的表达随氟化钠浓度的升高而增加；随着氟化钠染毒时间的延长，人非白血性白血病 细胞（human promyelocytic leukemia，HL-60）细胞中 Caspase3 逐渐被激活。这些研 究提示，氟诱导细胞的凋亡可能与 Fas/FasL 途径有关，但氟是否通过 Fas/FasL 途径诱 导神经细胞凋亡，目前尚未见报道。因此，本研究拟通过培养人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞接触不同剂量氟化钠（NaF）以及加入 Fas 受体激动剂(Anti-Fas, human, activating, clone CH11）或拮抗剂 (Anti-Fas, human, neutralizing, clone ZB4）来激活或阻断 Fas/FasL 途径后，观察 NaF 对细胞凋亡和 Fas、FasL、Caspase3、Caspase8 mRNA 表达的影响，从而探讨 Fas/FasL 途径在氟致 SH-SY5Y 细胞凋亡中的作用。1国家自然科学基金面上项目本研究主要由以下二部分组成第一部分氟对 SH-SY5Y 细胞凋亡、Caspase3 活性和 Fas、FasL、Caspase3、 Caspase8 mRNA 表达的影响目的探讨 NaF 对 SH-SY5Y 细胞凋亡、Caspase3 活性和 Fas、FasL、Caspase3、 Caspase8 mRNA 表达的影响。方法用不同浓度 NaF（20, 40, 80 μg/ml）体外染毒 SH-SY5Y 细胞，24 h 后检测细胞存活率、凋亡率、Caspase3 活性和 Fas、FasL、Caspase3、 Caspase8 mRNA 表达水平。结果与对照组比较，40、80 μg/ml 染毒组细胞存活率降 低，有统计学意义（P0.01）；细胞凋亡率随染毒剂量的升高呈上升趋势，且 40、80 μg/ml 染毒组细胞凋亡率高于对照组，差异有统计学意义（P0.05）；40、80 μg/ml 染毒组 Caspase3 活性及 Fas、FasL、Caspase3 和 Caspase8 mRNA 表达水平均高于对照组，差 异有统计学意义（P0.05）。结论NaF 可诱导 SH-SY5Y 细胞凋亡，引起 Caspase3 活性和 Fas、FasL、Caspase3、Caspase8 mRNA 表达水平升高。第二部分Fas 受体激动剂或拮抗剂对氟致 SH-SY5Y 细胞凋亡、Caspase3 活性 和 Fas、FasL、Caspase3、Caspase8 mRNA 表达的影响目的研究 Fas 受体激动剂或拮抗剂对氟致 SH-SY5Y 细胞凋亡、Caspase3 活性 和 Fas、FasL、Caspase3、Caspase8 mRNA 表达水平的影响。方法体外培养的 SH-SY5Y 细胞暴露于 NaF 或/和 Fas 受体激动剂 CH11 或拮抗剂 ZB4，24 h 后检测细胞凋亡率、 Caspase3 活性