杨玲《细胞与遗传实验》实验七-2016-基础班.pptVIP

细胞与遗传实验 杨 玲 细胞与遗传医学系 基因组DNA提取与PCR扩增技术 基因组DNA提取 目 的 基因组DNA的制备是基因分析的前提。 本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方法。 原 理 核内DNA 真核细胞，以核蛋白体形式存在 线粒体DNA 裸露，不与组蛋白结合 DNA 真核细胞基因组DNA提取 裂解：使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程 纯化：去除体系中的其他成分、多糖、脂类及其他不需要 的核酸（RNA）等生物大分子的过程 原 理 基因组DNA纯化试剂盒：在高盐的状态下，DNA纯化树脂UltraPureTM专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。 器材与试剂 台式高速离心机、水浴恒温箱、移液枪、塑料离心管等 试剂盒（纯化树脂、GN结合液、漂洗液、无水乙醇、离心纯化柱 ）、超纯水 操 作 1、培养细胞（Hela）一瓶，PBS洗涤一次。 2、加入PBS 0.5 ml，将细胞悬液转移至2ml 离心管（细胞刮、吸管） 3、向细胞悬液中加入1ml纯化树脂（使用前充分混匀），颠倒混匀5-6次，室温3min。其间要颠倒混匀1次，5000r/min离心×3sec收集沉淀；(吸水纸) 4、用1mlGN结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀， 5000r/min离心×3sec，收集沉淀； 6、用0.5ml漂洗液漂洗纯化树脂2次，颠倒混匀， 5000r/min离心×3sec，收集沉淀； 7、用0.8ml无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱，12000r/min离心×1min，弃乙醇液； 8、空柱再12000r/min离心×1min，进一步弃乙醇液； 9、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中，加入50ul 超纯水于纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3min，12000r/min离心×2min。 10、将离心管内的超纯水重新吸出，仍加至纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置2min,12000r/min离心×2min。 核酸浓度测定 DNA、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260nm处，所以，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。 一般情况下，纯净的DNA OD260/OD280比值约为1.8。若样品中含蛋白质，则比值下降，必要时需重新抽提。 DNA用TE溶解，可增加DNA的稳定性，便于长期保存。（也可用超纯水代替，如杂交时不能用TE，可能是与缓冲体系相冲突） 注意事项 PCR扩增技术 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）又称PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异的体外DNA聚合程序。 原理：体外模拟DNA的体内复制过程。 简述为： 在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP），和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物（上游、下游），有Mg2+存在。 实验原理 实验原理 加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。 降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。 溶液反应温度升至72℃，在Taq酶作用下，以四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。 如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。经过25～35个循环，DNA扩增倍数可达106～109。 实验目的 本实验以所提取的全基因组DNA为模板，以线粒体基因上一段核苷酸为靶目的片段，扩增出924bp的扩增产物。通过本次实验，学习并掌握PCR 反应的基本原理与实验技术。 器材和试剂 器材 PCR扩增仪，台式离心机，加样枪及枪头等 器材与试剂 试剂 1、Taq聚合酶Mix：Taq DNA 聚合酶、dNTP 、Mg2＋ 2、引物： Primer 1(上游):5’-ATGGCAAGCCAACGCCACTT-3’ Primer 2(下游):5’-CGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC-3’ 3、无菌d3H2O 4、模板DNA：为本次实验所提取的全基因组 DNA 和病人基因组DNA 操作 超纯水 10.