植物脯氨酸含量测定 脯氨酸在植物中的合成与相关酶活性测定.docVIP

植物脯氨酸含量测定 脯氨酸在植物中的合成与相关酶活性测定 导读：就爱阅读网友为您分享以下“脯氨酸在植物中的合成与相关酶活性测定”资讯，希望对您有所帮助，感谢您对92的支持! 脯氨酸在植物中的合成与相关酶活性测定 已证明高等植物体内存在2条脯氨酸合成途径，根据初始底物的不同分别命名为谷氨酸途径和鸟氨酸途径。谷氨酸（Glu ） 是前者的初始底物，鸟氨酸（Orn ）是后者的底物。在植物中，谷氨酸途径认为谷氨酸通过两步连续的还原合成脯氨酸，Δ-吡咯啉-5-羧酸（P5C ）为中间产物；催化反应的酶为P5C 合成酶（P5CS ）和P5C 还原酶（P5CR ）。鸟氨酸途径中GSA 是由转氨基作用生成的，后生成P5C ，最终被P5CR 还原成脯氨酸。Delauney 等人认为，在渗透胁迫条件下，P5CSmRNA 和δ-OATmRNA 表达与植物体内的氮素水平有关，在渗透胁迫和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位，而在非胁迫及高氮条件下鸟氨酸又居于主导地位。 调控植物体内脯氨酸含量高低的另一主要因素是脯氨酸的降解与代谢，降解过程基本是合成途径的逆过程，脯氨酸在线粒体中，通过脯氨酸脱氢酶（ProDH ）和吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（P5CDH ）的作用生成谷氨酸。 植物脯氨酸合成和降解有关的酶 Δ-二氢吡咯-5-羧酸合成酶（P5C synthetase ，P5CS ）和P5CR 是谷氨酸途径中的两个关键酶，其中P5CS 催化第一步反应，P5CR 催化最后一步反应，第一步反应为限速反应。P5CS 不仅具有谷氨酸激酶（γ-GK ）的活性，也具有谷氨酸半醛脱氢酶（GSADH ）的活性，即它是一个双功能酶，而且是合成反应的关键酶。渗透胁迫时植物体内积累Pro ，而Pro 积累与相应酶基因的有关。P5CS 基因在正常和胁迫条件下对植物中脯氨酸合成水平等方面均起着重要作用。Roosens 等研究表明盐胁迫下4周龄的拟南芥植物P5CSmRNA 表达却达到较高水平。另一方面，P5CR 基因受胁迫的影响不大，大豆P5CR 基因的转基因烟草植株体内P5CR 含量显著上升，但Pro 并未明显积累。相反，表达乌头叶菜豆P5CS 基因的转基因烟草中产生大量P5CS 酶蛋白，Pro 合成比非转基因植株上升10倍，这些结果表明，脯氨酸的增长受P5CS 的影响要大于受P5CR 的影响。袁星星等研究证明，CO 预处理还可有效提高盐胁迫下小麦幼苗根中吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS ）活性及其基因的表达，同时抑制脯氨酸脱氢酶（ProDH ）活性，从而诱导脯氨酸的大量合成，缓解盐胁迫对小麦幼苗的伤害。说明P5CS 是胁迫下植物细胞中Pro 合成的关键酶。 δ-OAT 是脯氨酸合成的鸟氨酸途径中的关键酶，有研究表明，拟南芥在盐胁迫和正常条件下，幼小植株的δ-OAT 活性和mRNA 都稍微高于较老植株，并且该基因的表达与盐胁迫和脯氨酸产物密切相关。余光辉等对假俭草的研究表明，在水分胁迫条件下，δ-OAT 的活性却显著增高，δ-OAT 的活性与脯氨酸的累积呈显著的正相关（r=0.96），而P5CS 的活性与脯氨酸的累积呈负相关（r=-0.93）。这说明假俭草植物脯氨酸的累积主要受到δ-OAT 活性的调节。吴亮其等将拟南芥δ-OAT 基因采用基因枪法导入粳稻品种中，通过PCR 及分子杂交分析的方法确定了δ-OAT 基因己插入水稻的染色体当中并且超量表达。通过检测结果表明， 水稻在受到水分胁迫时会积累大量的脯氨酸，而转基因水稻积累的脯氨酸是对照组的5-15倍。说明δ-OAT 基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要的作用。 脯氨酸降解由脯氨酸脱氢酶（ProDH ）和吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（P5CDH ）催化的。Peng Z 等克隆编码ProDH 的cDNA ，该cDNA 有一段序列具有输入线粒体蛋白的信号肽特征。并且，通过免疫的方法检测发现，线粒体中有ProDH 基因的表达产物吡咯啉-5-羧酸。有研究证明，把ProDH （脯氨酸降解酶）反义基因AtProDH 的cDNA 转到拟南芥植物中，从而抑制了脯氨酸脱氢酶的产量，抑制了脯氨酸的降解，提高了细胞内脯氨酸含量，增强了植株的抗渗透性，结果明显提高转基因植株对逆境的耐受性，提高对胁迫的抗性。植物中编码P5CDH 的cDNA 克隆分离还没未见报导。 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS ）活性的测定 P5CS 酶活性测定参照Hayzer 等与韩晓玲的方法，采用盐酸羟胺比色法测定。 1、酶液提取：称取水稻叶片0.5-1g ，加入3倍体积提取缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl pH7.5，10 mol/L MgC12，2mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF ），2%PVP），冰浴研磨，匀浆4冰冻离心（20，000g ）20min ，取上