-临床诊断PCR.ppt

Polymerase chain reaction, PCR 汇报人： 学号： 目 录 PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 解旋酶 解链酶 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3’ DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 Thermal Cycler Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 80 60 40 20 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 标准的PCR反应体系 4种dNTP混合物 各200μmol/L 引物 　　　　 　 0.1~0.5μmol/L 模板DNA 　　　 50ug Taq DNA聚合酶 1~2.5U/100μL Mg2+ 　　　　　 1~10mmol/L 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 55℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 引物1 引物2 DNA引物 Taq酶 Taq酶 第一个循环结束 * 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplic