T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。.ppt

实验 三、PCR产物的克隆 一、实验目的 学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法。并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术。 掌握DNA重组方法。通过本实验了解DNA重组技术在分子生物学研究中的重要意义。 二、实验试剂及材料 PCR产物（Taq，非Pfu），pUCm-T 质粒,E. coli DH5α Dl2000 DNA Marker, T4噬菌体DNA连接酶(5单位) 琼脂糖，T4 DNA ligase 及其缓冲液 TAE缓冲液(10×)，溴化乙啶染色液(10mg/ml) 凝胶回收DNA试剂盒II（安徽优晶生物公司） 上样液(6×): 0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液 6、 按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 　　　　7、 TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 　　８．麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后涂板。 三、实验器材 恒温水浴锅、PCR仪、台式低温离心机、移液枪、恒温培养箱、电泳仪、研钵、紫外分光光度计，一次性手套。涡旋振荡器， 电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。 三、实验原理 1、目的DNA片段的纯化： DNA纯化的主要目的是回收得到纯的目的DNA片段，去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段的试剂盒，有效地加快了DNA的纯化的速度。 DNA重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段通过DNA连接酶的的作用插入到质粒载体中的过程。 DNA片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进行复制。通过此方法可以对单个基因的功能进行研究。 2、DNA重组 本实验是将具有PCR产物以及T载体通过DNA连接酶连接起来。 连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即12~16℃。 因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及酶切位点等方面的问题。 载体的选择： 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。 载体及插入片段的量 主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。E. coli DNA 连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。T4噬茵体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步。 DNA连接酶 pUCm-T 生产厂家：生工 原始载体：pUC系列 宿主菌：实验室常用E. coli菌株如DH-5α 抗性：AMP 拷贝数：高 蓝白斑筛选：可以 测序引物：M13 注：本实验室自制T载体与此相同。 *PCR的扩增引物5’为A可以大大提高PCR后的加A效率有利于PCR产物的T-A克隆 Promaga T-载体和Teasy 载体图 质粒DNA的抽提原理 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤: 培养细菌使质粒扩增; 收集和裂解细胞; 分离和纯化质粒DNA。 采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色