2009-1蛋白质的分离纯化详尽演示教学.ppt

阳离子交换剂有: 羧甲基纤维素（CM- 纤维素）， 阴离子交换剂有: 二乙基氨基乙基纤维素（DEAE- 纤维素） ?纤维素离子交换剂： 是以微晶纤维素为基质，通过化学方法引入电荷基团构成的。 离子交换纤维素分子上的羟基被离子基团取代。 特点： 对蛋白质的交换容量大，结合力弱， 洗脱条件缓和， 因而是分离纯化生物活性大分子的理想的工具。 非特异性吸附少， 不易使蛋白质变性， 能引入大量活性基团而不破坏骨架 故交换容量很高 是将交换基团连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。 ?交联葡聚糖离子交换剂： 特点： 阳离子交换剂有:SE-Sephadex(强) CM-Sephadex(弱) 阴离子交换剂有：QAE-Sephadex(强) DEAE- Sephadex（弱） 表7-6 一些常用的纤维素离子交换剂和Sephadex离子交换剂 离子交换剂 可电离基团 I、阳离子交换剂 CM-纤维素（弱酸型） 羧甲基 P-纤维素（中强酸型） 磷酸基 SE-纤维素（强酸型） 磺乙基 SP-Sephadex(强酸型) 磺丙基 II、阴离子交换剂 AE-纤维素（弱碱型） 氨基乙基 PAB-纤维素（弱碱型） 对氨基苯甲基 DEAE-纤维素（中强碱型） 二乙基氨基乙基 DEAE-Sephadex（中强碱型） 二乙基氨基乙基 TEAE-纤维素（强碱型） 三乙基氨基乙基 QAE-Sephadex（强碱型） 二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基 指单位重量交换剂中可解离基团的数量，是离子交换剂的特性 常用单位重量或单位容积交换剂的能交换的毫克当量离子来表示； 交换容量 影响交换容量的因子： 筛孔 离子强度 pH （3）离子交换层析条件的选择 1）离子交换剂的选择 交换容量是提供交换离子的量度，是选用交换剂数量的重要参考依据。 选用何种交换剂还要根据被分离的物质所带电荷、分子大小，及是否耐酸碱等对离子交换剂进行选择。 1）凝胶的聚合 有自由基存在 引发产生自由基的方法 化学法 光学法 ① 化学聚合 催化剂: 过硫酸铵（AP） 加速剂: 脂肪族的叔胺: 其中以TEMED为最好。 四甲基乙二胺（ TEMED） 三乙醇胺 二甲基氯丙腈等 丙烯酰胺、Bis和TEMED的水溶液 过硫酸自由基 TEMED 丙烯酰胺单体 聚合 含有酰胺基侧链的脂肪族多聚链 通过Bis交联 三维网状结构 通常需要痕量氧的存在， ②光聚合: 以核黄素为催化剂， 不加TEMED即能聚合，但加入可加速聚合 过硫酸铵 激活 活化 一般光聚合用于制备大孔胶，化学聚合用来制备小孔胶。 核黄素 光解 无色基 被氧化 自由基 引发 聚合作用 2)影响凝胶聚合的因素 丙烯酰胺，选择电泳纯级的产品。 过硫酸铵溶液需新鲜配制。 ? 试剂的纯度 ? 凝胶浓度 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小取决于反应体系中单体和双体在凝胶中的总浓度(T)和交联度(C)。 通常凝胶的孔径、透明度和弹性随着凝胶浓度的增加而降低， 而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。 式中a代表单体Arc的重量（g） b 代表交联剂Bis的重量（g） m 代表溶液的体积（mL)。 凝胶浓度的计算公式 T％ = a+b m ? 100％ 交联度的计算公式 C％ = b (a+b) ? 100％ 当a:b 10时 凝胶变硬呈白色； 当a:b100时 5%凝胶呈糊状，且易断裂。 交联度随着总浓度（T）的增加而降低。 因此，当总浓度一定、交联度增加时，将导致筛孔直径降低。 Richard等在1965年提出适合于确定凝胶浓度为5%-20%范围内交联度的经验公式： C = 6.5 - 0.3T 如选用总浓度T分别为5%和10%时，依照上述公式便可计算出交联度C应分别为5%和3.5% Fawcett提出了另一种看法： 当凝胶总浓度不变，交联度为5%时，筛孔直径最小； 大于或小于此交联度时，筛孔直径均变大。 因此，目前有些实验室采用a:b = 19:1的配方。 显然C值可由T值决定的，或者是固定值（5%）。 而T值则依据分离物质的分子质量大小来确定。 标准凝胶: 是指浓度为7.5％的凝胶。。 凝胶浓度过大，凝胶透明度差，而且因其硬度及脆度较大，容易破碎； 凝胶浓度太低时，形成的凝胶稀软，不易操作。 温度高聚合快，温度低聚合慢，一般以23℃～25℃为宜。