4-1-蛋白质的分离纯化培训资料.ppt

第四章 蛋白质的获取、分离和鉴定 ;主要内容; 生物体组织 预处理 破碎，溶解，离心分离 抽提 无细胞抽提液 粗分级 溶解度分级法 等电点沉淀法 细分级 亲和层析 分子筛 离子交换层析 电泳法 蛋白鉴定 蛋白质样品;蛋白纯化全过程中要注意的问题： 始终要控制pH值 通常要保持低温 Why? 减少溶液环境的有害影响 不要反复冻溶 减少蛋白质变性 ;一 材料的选择与处理;蛋白抽提缓冲液:;例子：双向电泳样品抽提液的一种配方：;蛋白质的初步提纯/ 粗分级;有机溶剂分级沉淀;超离心法 Ultracentrifugation 1. 原理 利用物质的沉降系数，质量，浮力因子等方面的差异，用强离心力使其分离，提纯的技术。 2. 方法 A. 沉降速度法 根据被分离物沉降系数 (sedimentation coefficient)的不同 差速离心法（differential centrifugation） 速度-区带离心法（rate-zonal centrifugation） B. 沉降平衡法 根据被分离物密度(density)的不同 等密度离心法（isodensity centrifugation） 平衡等密度离心法（equilibrium isodensity centrifugation） 效果不错 但是需要昂贵的仪器;等电点沉淀;透析 原理：利用半透膜的选择性透过作用。 可用于粗分级，也用于浓缩；脱盐 常在盐析之后进行 超滤 原理：利用超滤膜的选择性透过作用 分辨率不错 但是成本较高;PEG沉淀： 可通过沉淀蛋白，去除上清中的杂质 三氯乙酸（TCA）沉淀 蛋白会变性 丙酮沉淀 要根据自己的实验目的，选择合适的粗分级方法！ ;三 蛋白质的进一步提纯/ 细分级; 静相 stationary phase 动相 mobile phase 物质在溶剂1中的浓度 物质在溶剂2中的浓度 物质在一相中的总量 物质在另一相中的总量 ;种类：;二. 分配层析和吸附层析 1.分配层析 Partition Chromatography 原理：化合物在两个液相间发生分配???用 This form of chromatography is based on a thin film formed on the surface of a solid support by a liquid stationary phase. Solute equilibriates between the mobile phase and the stationary liquid. Rf值： 种类：纸上层析，柱上层析（纤维素作载体） ; ; 原理：各种物质对吸附剂吸附程度不同，以及 物质在相应的溶剂中溶解度的差异。 柱上层析法：常用吸附剂硅胶，磷酸钙，氧化铝等 TLC (thin layer chromatography)：吸附剂涂在玻板上;;1. 原理 固定相和流动相之间发生的可逆的离子交换反应 Ion exchange chromatography is a form of adsorption chromatography which separates molecules on the basis of their charge.;Why use ion exchange?;Sample application and wash;What happens in ion exchange?;What happens in ion exchange?;What happens in i