试验十一骨髓细胞染色体制片与观察.pptVIP

实验十一 骨髓细胞染色体制片与观察 一、实验目的 掌握骨髓细胞的染色体制片技术。 观察染色体的形态特征，统计细胞的染色体数目。 二、实验材料 小白鼠（2n=40）或蟾蜍、蛙类等任选一种。 三、实验原理 骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。 四、实验器具和药品 1.器具：注射器（1ml，5ml各一支）、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 2.药品：0.02%秋水仙素，0.075N氯化钾，固定液（3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配），Giemsa染液，2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液（PBS）pH6.8。 五、实验步骤 1.秋水仙处理 取健康小白鼠或青蛙一只，按4ug/g体重的剂量，腹腔注射秋水仙素，3～5小时后取材。 2.取骨髓 处死动物，立即剪开后腿的皮毛，取出股骨，剔去肌肉，并用白纱布包在股骨上反复搓动，以除净其上的肌肉碎渣和结缔组织。 3.取骨髓细胞 剪开股骨的两端，使骨髓露出，用注射器吸取2%柠檬酸钠，插入股骨的一端，缓慢冲洗骨髓腔，冲洗液从另一端滴到离心管，反复冲洗直至股骨变为灰白色，并用吸管打散细胞团。 冲洗液经1000rpm离心10min后弃上清液。 4.低渗 在离心管中加入0.075N氯化钾5ml，用吸管吹打均匀，37℃恒温水浴锅低渗20～30分钟，1000rpm离心10min，去上清液。 5．固定Ⅰ 沿离心管壁缓慢加入固定液5mL，吸打均匀后静置10min，1000rpm离心10min后弃上清液。 6.固定Ⅱ 同固定Ⅰ。 7.滴片 从冰水中取出载片，迅速用吸管取细胞悬液1～2滴滴在载片上（滴片的高度30cm～40cm，滴面不要重复）、立即用口向同一方向吹，使细胞染色体分散，然后于酒精灯上微微加热干燥，或室温下凉干。 8.染色 Giemsa染液（pH值7.2）扣染20分钟，自来水冲洗，干燥后即可 9.镜检 低倍镜寻找中期分裂相，然后用高倍镜和油镜观察染色体形态，统计染色体数目。 六、作业 1.找到一个分裂相良好的区域，进行显微照相。 2.统计小鼠2n染色体的数目，仔细观察其形态特征并绘骨髓细胞中期染色体。 3.低渗液起到什么作用，在使用过程中应注意什么问题？ 4.你在实验中遇到哪些问题？如何分析和解释？ 5.交一张制作好的染色体玻片标本。 * *