研究生实验五大肠杆菌感受态的制备、重组dna的转化和抗药性筛选 课件.ppt

大肠杆菌感受态的制备、重组DNA的转化和抗药性筛选;;1 感受态(competent);1.1 制备感受态细胞的原理; 1、CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5?106-2?107转化子/?g质粒DNA,简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。 2、电穿孔转化法：通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子； 3、脂质体(liposome)法：阳离子脂质体能将DNA分子包裹入内，形成DNA一脂复合体，将DNA传递进入细胞； 4、胞核的显微注射法(microinjection)； 5、磷酸钙介导的转染：将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成极小的不溶的磷酸钙颗粒，粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞 的细胞质 ； 6、聚乙二醇介导的原生质体转化法：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。 ; 1. 一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细菌处于冰冷（0℃）0.05-0.1M的 CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。 2.在转化体系中形成DNA-抗DNase的羟基-磷酸钙复合物能粘附于细菌表面，经过42℃短时间热休克（heat shock）处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙促进感受态细胞吸收DNA复合物。 3.在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养(selective culture)平板上即可筛选出所需的转化子。 ;;弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1 mol/L CaCl2 300 μl，重悬菌体，冰浴20 min;? 用无菌弯头玻璃铺菌器将200 ?l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面? 室温放置10 min，使液体被吸收 ? 倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长 ;重组体克隆的筛选与鉴定;;基因克隆;基因克隆示意图;基因克隆基本步骤;（4）转（转化至宿主细胞）：将重组体引入（转化或转染）到宿主细胞（受体细胞）中，转化后的细胞进行扩增繁殖，获得大量的细胞繁殖群体。 （5）筛（筛选阳性细胞克隆）：从大量的细胞繁殖群体中筛选出转化成功（带有重组体）的阳性细胞克隆。 ;1 目的基???的获取;2 克隆载体的选择和构建;3 外源基因与载体的连接;③同聚寡核苷酸末端连接 ④人工接头分子连接：;四 重组DNA导入宿主细胞;五 重组体的筛选;(直接选择法) 抗药性标记选择;(插入失活法) 抗药性标记选择; α 互补的检测 ;。 ;放射性抗体检测法;Thank you!