分子生物学第五章 分子生物学研究法1精品.pptVIP

5.3 RNA基本操作技术 （2）反转录成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶。 应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA的方向性。 5·4 核苷酸序列分析 仪器分析发展很快。 如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。 如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。 下面介绍测序的基本原理。 5·4 核苷酸序列分析 Sanger双脱氧链终止法 　　　利用ＤＮＡ聚合酶能够利用双脱氧核苷三磷酸作底物掺入到核苷酸链中而终止ＤＮＡ链的生长（双脱氧核苷三磷酸没有３ˊ－ＯＨ基团）。 5·4 核苷酸序列分析 Maxam-Gilbert化学修饰法 　　　硫酸二甲酯、肼、六氢吡啶→放射标记ＤＮＡ片段→碱基特异性切割→不同长度ＤＮＡ片段→凝胶电泳和放射自显影→读出ＤＮＡ序列。 5·4 核苷酸序列分析 ＤＮＡ序列分析自动化 　　　四甲基若丹明作荧光剂。 　　　激光 　　　计算机自动分析 5·4 核苷酸序列分析 ＤＮＡ杂交测序法（ＳＢＨ） 　　　寡核苷酸探针＋靶ＤＮＡ→完全双链杂交分子→比较分析→推断靶ＤＮＡ序列 5·4 核苷酸序列分析 ＤＮＡ杂交测序法（ＳＢＨ） ３－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－５ 　　　　Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ａ 　　　　　　Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｃ　　 　　　　　　　　Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｔ 　　　　　　　　　　Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｔ －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ５ －Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｔ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｔ－Ｇ－Ａ－Ａ－３ 酶及其浓度 　 　　　目前有２种Taq DNA聚合酶， 催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100uＬ时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度　 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris－HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。 在PCR反应中，dNTP应为50-200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸　 　　　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 　　　SDS主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 　　 蛋白酶K能水解蛋白质，特别是组蛋白，再用有机酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。 　　　RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度　 　　　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，PCR反应中各dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度　 　　　Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR的基本原理 DNA模板 DNA引物 dNTP TaqDNA聚合酶 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 P