微生物的平板菌落计数法.docx

?/jpkc/2010/spwswx/htm/34.html实验十三 微生物的平板菌落计数法???一、实验目的学习微生物的平板计数法。二、原理概述微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成，且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的。也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在 ( 否则一个菌落就不只是代表一个菌 ) ，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数，一般用于某些成品检定 ( 如食品等 ) 、生物制品检定、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检定。三、实验器材1 、待测样品、所需各类培养基2 、天平、称样瓶、记号笔、容量瓶、无菌生理盐水、 1ml 和 5ml 无菌移液管、无菌平板、无菌试管四、操作步骤和内容1 、样品稀释液的制备准确称取待测样品 10g 或 10ml ，放入装有 90ml 无菌水并放有小玻璃珠的 250mL 三角瓶中，用手或置摇床上振荡 20min ，使微生物细胞分散，静置约 20-30s ，即成 10 -1 稀释液；再用 1ml 无菌吸管，吸取 10 -1 稀释液 1ml 移入装有 9ml 无菌水的试管中，吹吸 3 次，让菌液混合均匀，即成 10 -2 稀释液；再换一支无菌吸管吸取 10 -2 菌液 1mL 移入装有 9ml 无菌水试管中，即成 10 -3 稀释液；以此类推，一定要每次更换吸管，连续稀释，制成 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 、 10 -7 、 10 -8 等一系列稀释度的菌液，供平板计数使用 ( 如图 13 － 1) 。图 13 － 1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，多采用 10 -7 、 10 -8 、 10 -9 稀释度的菌液；测定土壤细菌数量时，多采用 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 稀释度的菌液；测定放线菌和真菌数量时，多采用 10 -3 、 10 -4 、 10 -5 稀释度的菌液。2 、平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。该实验采用混合平板培养法计数：将无菌平板编上 10 -7 、 10 -8 、 10 -9 号码，每一号码设置 2 个重复，用 1 毫升无菌吸管按无菌操作要求吸取 10 -7 稀释液各 1 毫升放入编号 10 -7 的 3 个平皿中，同法吸取 10 -8 稀释液各 1 毫升放入编号 10 -8 的 3 个平皿中，再吸取 10 -9 稀释液各 1 毫升，放入编号 10 -9 的 3 个平皿中 ( 由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换 ) 。然后在 6 个平皿中分别倒入已融化并冷却至 45-50 ℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，适温培养，至长出菌落后即可计数。放线菌和真菌同法可得。3 、结果计算计算结果时，常按下列标准从接种后的 3 个稀释度中，选择一个合适的稀释度，求出每克待测样品中的含菌数。计数时应选取菌落数在 30-300 之间的平板作为菌落总数测定的标准，每个稀释度使用两个平板，应取其平均值。这是因为稀释度过高，菌数少，误差大，稀释度过低菌数多，不易得到分散的菌落，也不易数清。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于 0 － 4 ℃，但不得超过 24h 。如果其中一个平板有较大片状菌落时，不宜采用此平板，仅用没有片状菌落的平板即可。如果全部都有片状菌落，但片状菌落不足皿面积的一半，其余菌落分布十分均匀，可以计算半个皿后乘 2 来代表全皿的菌落数。如果一个平板在 30-300 之间，另外一个不在 30-300 之间，则仅用在 30-300 之间的平板来计数。当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。当在琼脂与培养皿的底部、培养基表面、培养基边缘出现水膜样的蔓延菌落时，一般是由于蔓延处发生水汽聚集的缘故。当蔓延超过 1/4 时要避开，超过 50 ％时，应报告为实验室事故。当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于 300 时），但分布很均匀，可取平板的一半或 1/4 计数。再乘以相应倍数作为该平板的菌落数。有二个稀释度均在 30-300 之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比