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融合重组的频率可用下式表示： 融合重组频率 = 融合重组子 两亲株原生质体再生菌落的总数 × 100% 原生质体融合技术的实际应用，其关键环节是准确地选出优良性能的融合子，而这个选择往往是上述几种方法相互配合使用。 5 基因工程 基因工程：指通过人工方法将目的基因与载体DNA分子连接起来，然后导入受体细胞，从而使受体细胞获得新的遗传性状的一种崭新的育种措施。 技术上的三大发明为基因工程提供了可能 1、DNA的特异切割?? 1970年Smith和Wilcox等人从流感嗜血杆菌中分离出特异切割DNA的限制酶。从而为人们随意切割DNA提供了一把利剪。 2、DNA连接酶的发现 ? 1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，这种酶能够参与DNA裂口的修复。 3、基因工程的载体（质粒）的发现： 从1946年起，LEDERBERG开始研究细菌的性因子--F因子，经过50年代和60年代，相继发现其它质粒，如抗药因子（R因子），到1973年COHEN将质粒作为基因工程的载体使用 5.1 基因工程工具酶——限制性内切酶 1)定义：是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。 2)命名和分类 ?? 命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示。 ? 如：E.coli中的E表示大肠杆菌属名第一个字母，co表示种名头两个字母，l表示株名，i表示该菌中第一个被分离出的酶。 3) 限制性内切酶的基本特性 （1）形成粘性末端???? （2）形成平末端 常用限制酶的种类及切割方式 切点出现的频率及片断大小 5.2 核酸的提取操作和检测技术 1）质粒DNA的提取???? 2）电泳和DNA紫外检测 5.3 基因工程的基本操作步骤 1)目的基因的取得 2) 载体的选择 3)目的基因与载体DNA的体外重组 4)重组载体引入受体细胞 5)表达筛选 染色体DNA或化学合成DNA 酶切和连接 克隆载体或表达载体 重组载体 宿主细胞 转化 扩增 筛选 重组体克隆 定位诱变 寡核苷酸 鉴定、测序 工程菌 工程动物 工程植物 表达产物 后处理 优良品种 选育 基因工程基本操作过程示意图 目的基因的取得 选择目的基因的途径有3种： 1）? 从适当的供体细胞的DNA中分离有生产意义的目的基因。 2）? 通过逆转录酶的作用由mRNA合成cDNA。 3）? 由化学方法合成特定功能的基因。 载体的选择 载体必须具备下列几个条件： 1）是一个有自我复制能力的复制子?? 2)?? 能在受体细胞内大量增殖，即有较高的复制率。 3） 载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上。 4）? 载体上必须有一种选择遗传标记，如具有四环素等的抗性基因，以便及时将“工程菌”选择出来。 载体的种类 1）细菌质粒载体 2）入噬菌体载体 3）柯斯质粒载体 4）M13噬菌体载体 5）真核细胞的克隆载体：酶母质粒载体、病毒 载体 6）人工染色体 对目的基因与载体DNA均采用限制性内切酶的处理或人为在DNA的3’末端加上polyA或polyT，使两个DNA产生互补粘性末端，然后把两者放在较低温度下混合“退火”处理，双链重新形成，在外界连接酶的作用下形成一个完全有复制能力的环状重组载体。 目的基因与载体DNA的体外重组 重组载体引入受体细胞，使基因扩增和表达出供体基因所提供的部分遗传性状。受体细胞可以是微生物细胞，也可以是动物或植物细胞。把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多。若以重组质粒作载体时，可以用转化的手段；若以病毒DNA作重组载体时，则用感染的方法。 表达筛选 1、? 抗生素平板法 2、? 插入失活法 3、? 插入表达法 4、β-半乳糖苷酶显色反应法 重组载体引入受体细胞 三、基因工程的应用 一)基因工程药物 ： 胰岛素? ?二)转基因植物：转基因棉花 ?三)转基因动物：转 基因猪、鱼等 四)基因治疗：向靶细胞中引入具有正常功能的基因。 谢 谢 微生物遗传变异与育种 第五节 工业微生物育种 微生物育种的目的就是利用微生物遗传学的原理和方法，人为地在DNA水平解除或突破微生物的代谢调节控制，使某种代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，实现人为控制微生物，获得我们所需要的高产、优质和低耗的菌种。