第七章 生物技术在抗生素中的应用.ppt

第一节 基因工程的应用 （1）链霉菌抗生素生物合成基因结构的典型特征之—，是高G-C碱基组成，(G-C)的百分含量达70%以上。三联体密码子中的第3个碱基的G、C比例极高 利用这一特性，成功地预测了链霉菌的酪氨酸酶基因以及红霉素链霉菌的红霉素抗性基因的转录方向。 基因的特点 （2）根据对不同化学类别的抗生素生物合成基因的定位研究，发现参与每种抗生素生物合成的基因约为l0一30个，几乎总是成簇存在的， 如次甲霉素、新霉素、红霉素、紫霉素、卡那霉素、土霉素、链霉素、嘌罗霉素、氯霉素的生物合成基因都在一个基因簇中。 基因的特点 （3）抗生素生物合成基因除定位在染色体上外，还发现有的定位在质粒上。 次甲霉素A生物合成基因就定位在天蓝色链霉菌的SCP1质粒上。 二、克隆抗生素生物合成基因的方法 ①阻断变株法； ②突变克隆法： ③直接克隆法； ④克隆抗生素抗性基因法 ⑤寡核甘酸探针法； ⑥同源基因杂交法； ⑦在标准系统中克隆检测单基因产物法。 ①阻断变株法 通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆DNA片段的性质。 首先经诱变获得一系列生物合成阻断变株， 从野生型菌株中分离DNA，与载体连接后转入阻断变株，以抗生素表型的恢复作指标，克隆生物合成不同阶段的酶基因。 放线紫红素(actinorhodin)是天蓝色链霉菌产生的酸碱条件下由红变蓝的指示剂抗生素。根据色素差异和合成反应，将76株突变体按表型分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组，每组代表不同生物合成步骤发生的损伤。 用低拷贝质粒pIJ 922的BamHI位点从act+菌株中克隆了一个25kb的片段，并转化阻断突变株，能互补除act V以外的所有突变体。 在此基础上又组建了pIJ2303质粒，它能互补所有7类突变体。所以，质粒pIJ2303上的外源DNA片段携带了放线紫红素生物合成的全部信息。 ②突变克隆法 突变克隆技术是指利用整和质粒或噬菌体将原株DNA转入到抗生素产生菌中，由于基因有同源性，有可能发生基因重组，一旦某DNA片段的插入干扰了原株某个生物合成基因的转录，即得到了这个生物合成基因的阻断变株，其相应的DNA片断就是这个阶段的生物合成基因。 ③直接克隆法 由于抗生素生物合成基因往往成簇存在，使得有可能克隆整套生物合成基因。 主要用于基因簇相对较小(＜30kb)的抗生素生物合成基因。 ④克隆抗生素抗性基因法 抗生素生物合成基因和抗性基因是连锁的 一般抗性基因只有1—2kb，较易检测和克隆。 利用己克隆的抗性基因作为探针，从产生菌基因文库中分离与之同源并带有生物合成基因DNA片段。 ⑤寡核苷酸探针法 链霉菌基因对密码子的利用有明显的不随机性，即DNA中G十C的比例为70％以上，密码子第三位有90％以上常为G或C。 抗生素生物合成酶被分离纯化后，就可能获得这些酶的部分氨基酸序列。根据氨基酸序列推导设计出较低程度简并性的基因序列，人工合成寡核苷酸并作为探针，就可从基因文库中克隆生物合成基因。 ?-内酰胺类抗生素生物合成途径中的第一个有生物活性的中间体是异青霉素N是由pcbC基因编码的异青霉素N合成酶（IPNS）酶促形成的。这种基因是采用“反向遗传学”方法克隆到的。 牛津大学的Abraham和同事首先纯化了IPNS 。礼莱公司的研究者则获得其N末端氨基酸序列。根据已知的氨基酸序列，以合成的寡核苷酸为探针，通过杂交来识别含有相关DNA序列的克隆体、经DNA序列分析发现一个可读框。并能在大肠杆菌中表达，这种重组大肠杆菌可产生IPNs，故证实已克隆到了Pcbc基因。 ⑥同源基因杂交法 利用一种已克隆的抗生素生物合成基因片段为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆抗生素生物合成基因。 由于基因保守序列的同源性，利用同源基因杂交法克隆化学结构类似的抗生素生物合成基因是比较快速准确的方法。 ⑦在标准系统中克隆检测单基因产物法 如果有单酶基因表达产物的检测方法，可以利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌的DNA克隆到最常用的宿主——变青链霉菌中，通过检测宿主菌中的个别基因产物，筛选克隆子从而分离到相应的基因。 三、提高抗生素产量的方法 利用基因工程技术有目的地定向改造基因、提高基因的表达水平以改造菌种的生产能力