七=外源基因在真核细胞中的表达以及调控.ppt

外源基因在真核细胞中的表达与调控;基因工程的基本程序;基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。 基因工程技术的核心是基因表达技术。 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。 ; 一、概 述;;2、据受体细胞的不同可分为： 1）原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2）真核表达系统： 使外源基因在真核细胞中表达的体系。;（二）原核表达系统的局限性;真核基因组结构复杂庞大:形成复杂的染色质或者染色体 基因不连续性:内含子、外显子 3.含有大量的重复序列：低度、中度或高度 4.存在许多基因家族（有一定同源性而又不完全相同的基因簇）：如珠蛋白基因家族、ras基因家族等。 5.没有原核细胞的操纵子，不产生多顺反子mRNA: 即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链 (单顺反子mRNA）。 6.基因表达调控复杂 ;;;;转录前调控;转录水平调控;酶;顺式调控因子;启动子; 启动子结构模式图;;表－1　哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中 常见的元件;增强子;;负性调控元件;;反式作用因子;转录信号1; 反式作用因子可以分为3类： （1）普通转录因子（通用转录因子）：主要识别启动子的核心启动成分，如TATA盒结合因子TFIID； （2）组织特异性转录因子：是特殊组织与细胞中的反式作用因子，如淋巴细胞中的Oct-2； （3）诱导性反式作用因子：与反应性元件（response elements）相结合的反式作用因子。 如HSRE（热休克反应元件，heat shock response element） GRE（糖皮质激素反应元件，glucocorticoid response element） CRE（cAMP反应元件，cAMP response element） ;反式作用因子的结构;螺旋转角螺旋;;1、RNA加工成熟：无论是rRNA、tRNA、mRNA，转录后都必须经过加工，才能成为有功能的分子。 rRNA：前体是45S，成熟的rRNA是18S、28S、5.8S，还要经过化学修饰--核糖甲基化。 tRNA：首先经过核苷的修饰，生成4.5S前体tRNA，再剪接成为成熟的tRNA。 mRNA：5’加帽子，3’加poly(A)，还要经过剪接以及核苷酸的甲基化修饰。;; 真核生物的基因可以分为两大类：一类是简单的转录单位；另一类是复杂转录单位。转录后加工方式是不同的。 （1）简单转录单位：编码产生一个多肽，转录后加工有3种形式。 a、基因没有内含子，转录后无需加工，也没有poly(A), 如组蛋白基因。 b、没有内含子，无需剪切，但需要加poly(A)尾，如α-干扰素基因。 c、有内含子，需要加工，及加poly(A)尾，但它们只产生一个有功能的mRNA，如ɑ,β-珠蛋白基因。 ;;初级转录产物可通过不同的方式加工成两个或两个以上的mRNA。 a、利用多个转录起始点或剪接位点产生不同的蛋白质。 b、利用多个加多聚（A）位点和不同的剪切方式产生不同的蛋白质。 c、虽无剪接，但有多个转录起始位点或加poly(A)位点。 ;利用多个转录起始点或剪接位点产生不同的蛋白质;;利用多个加多聚（A）位点和不同的剪切方式产生不同的蛋白质;虽无剪接，但有多个转录起始位点或加poly(A)位点;翻译水平的调控;;1. 多肽的切割：切去前端的信号肽 2. 多肽的有限水解：蛋白质（酶原）必须经过有限的酶和化学水解才能变成有活性的物质。 3. 多肽的化学修饰：蛋白质磷酸化、糖基化（糖蛋白）、乙酰化。 4. 多肽的剪接：多肽被剪接成数个片段，再以一定的顺序结合起来，形成有活性的蛋白质。;二、真核表达系统;（一）真核表达系统的必要性和优势;（二）真核表达载体; 真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。;真核表达载体带有的polyA 加尾信号可保证新转录的mRNA能有效地加上poly A。;（三）真核表达系统; 酵母表达系统;特点及优势;（一） 酵母载体; Leu-作为酵母载体的选择标记基因 ;