高效液相色谱原理-第一讲.ppt

高效液相色谱 4.色谱法原理 色谱法的原理 利用混合物中各组份在不同的两相(流动相、固定相）中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。 由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此，在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂 5.色谱法的分类 (1)按分离过程的机理分: 吸附色谱(Absorption Chromatography) 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离 分配色谱(Partition Chromatography) 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography) 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC) 亲和色谱 (2) 按流动相的物态分: 气相色谱 (Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱 (Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又叫洗脱剂) (3) 按固定相的形态分: 平面色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱 色谱法分类示意图 1. HPLC的产生 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法 柱效低、时间长(常有几个小时)。 高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC) 是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。 与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC). 因分析速度快而又称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 HPLC 是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段 2.高效液相色谱的固定相 (1) 固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体 和硬胶两大类。 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。 全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒细(5～10?m)，孔仍然较浅，传递速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及衡量分析。 3.液相色谱的流动相 (2) 流动相类别 (3)流动相选择 (4)流动相的要求 流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： 高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。 化学稳定性好 低粘度(粘度适中) 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离 ①常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等； ②但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。 (5)选择流动相时应注意的几个问题 尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 (一)吸附(液-固)色谱 (二) 分配（液-液）色谱 基本原理：利用试样各组分在固定相和流动相上的分配比例不同而分离。在固定相上分配多的组分（分配系数高）后出峰，分配少（分配系数低）的先出峰。 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。 (三)离子交换色谱 (四)体积排阻色谱 (五)亲和色谱