生物：5.3《血红蛋白的提取和分离》教学讲稿(新人教版选修1).pptVIP

4.透析血红蛋白 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 1mL 利用透析袋透析 透析过程 返回 纯化－－凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 教材图5－19 3.样品的加入和洗脱 （二）凝胶色谱操作 （1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 装配好的凝胶柱 返回 材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填: 2.凝胶色谱柱的装填： 步骤 操作要求 ① ② ③ ④ ⑤ 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 洗涤平衡 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 装填悬浮液 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配制凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 课题3 血红蛋白的提取和分离 专题5 DNA和蛋白质技术 一、基础知识: 学生活动1: 1 、分离生物大分子的基本思路是什么？ 2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？ 3 、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？ 4 、为什么不用鸡的血红细胞而用人的血红细胞作为实验材料？ 5 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质 ？ 一、基础知识--蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质： 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。 提取分离方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 （1）原理： （2）材料 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 (一)凝胶色谱法 （3）分离过程 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 (一)凝胶色谱法 (一)凝胶色谱法 1 、什么是缓冲液？ 2、 缓冲液的作用是什么？ 学生活动3: 3、 缓冲液是如何配制的？你所学过的人体 血液的缓冲物质有哪些？ 4、 本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？ （二）、缓冲溶液 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等 缓冲溶液－－洗脱剂 组成： 配制： 作用： 调节缓冲剂的比例，可配制不同pH的缓冲液。 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。 （二）、缓冲溶液 1 、什么是电泳？ 2、 影响电泳迁移速度的因素有哪些？ 学生活动4: 4、电泳分离各种分子的原理是什么？ （三）、电泳 3、 如何消除电荷对电泳迁移速度的影响？ 5 、请描述电泳的过程？ 2．凝胶电泳法： （1）原理： 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 影响蛋白质分子运动速度的因素 (三)电泳 1.电泳的概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程. 影响蛋白质分子运动速度的因素 ? 决定 运动方向 形成 库仑力 形成 阻力 决定 运动速率 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 √ √ √ √ √ √ √ 在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电； 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 （2）分离方法： （3）分离过程： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 (三)电泳 电