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电镜技术的应用 电镜技术的应用 电镜技术的应用领域很宽，在声明科学领域可用与胚胎及组织发生学方面的援救和观察，如通过电镜可以了解肿瘤间质新生血管芽的发生和形态特点；临床上可用于多种疾病亚细胞结构变化的观察和诊断，特别是肾小球疾病及肌病的诊断，以及一些疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定，如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断；最早关于细胞凋王的形态学描述也是源于电镜的观察。电镜技术也有其局限性，有时还可能遗漏信息；当用于辅助肿瘤外检诊断时，只能判定组织或细胞的来源，不能确定肿瘤的良恶性质。 原位多聚酶链式反应 原位多聚酶链式反应技术是多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术的一部分， 原位PCR技术 原位PCR技术 原位PCR技术有直接法原位PCR，间接法原位PCR，原位反转录PCR(in situ reversetranscription-PCR)和原位再生式序列复制反应(self-sustained sequence relication reaction,3SR)等方法，其中应用较广泛的是间接原位PCR方法。其主要程序有组织固定，预处理（如蛋白酶K和RNA酶消化），原位扩增及扩增产物的原位杂交和检测等。由于使用原位杂交技术对扩增产物做检测，使该方法的特异性较直接法高。 原位PCR技术的应用及目前存在的问题 原位PCR技术能用于低拷贝的内源性基因的检测和定位，在完整的细胞样品上能检测出单一拷贝的DNA序列，可用于基因突变，基因重组和染色体易位等的研究和观察。还可用于外源性基因的检测和定位，如对各种感染性疾病病源的基因检测，如EB病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒基因组及结核、麻风杆菌基因的检测等，在临床上还可应于对接受了基因治疗患者体内导入基因的检测等。 从理论上讲，原位PCR是一个较完美的技术，兼有较高的敏感性和基因的细胞内定位功能，但该技术目前还欠完善，主要表现在以下几个方面：①特异性不高，特别是假阳性的问题。可能产生假阳性的原因有引物扩增序列的弥散等。提高其检测结果的特异性，必须设计酶处理后样品的阴性对照等；②技术操作复杂，影响因素太多；③需要特殊的设备，即原位PCR仪，多为进口，价格昂贵，加之技术上存在的问题等，短时间内还难于在国内大面积推广使用，但有一定的潜在使用前景。 核酸原位杂交技术 原位杂交（in situ hybridization,ISH）是核酸分子杂交的一部分，是将组织化学与分子生物学技术相结和来检测和定位核酸的技术。它是用标记了的已知序列的核苷酸片断作为探针(probe)，通过杂交直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位某一特定的靶DNA或RNA的存在。其生物化学基础是DNA变性，复性和碱基互补配对结和。根据所选用的探针和待检靶序列的不同，有DNA—DNA杂交、DNA—RNA杂交和RNA—RNA杂交。 探针的选择和标记 用于原位杂交的探针有双链cDNA探针，单链cDNA探针，单链cRNA探针和合成的寡核苷酸探针等。一般而言，探针的长度以50∽300个碱基为宜，用于染色体原位杂交的探针可为1.2∽1.5kb。探针标记物有放射性核素3H、35S、32P等，这类探针的敏感性高，但有半衰期和放射性污染，成本也高且耗时，故其使用受限；非放射性核酸标记物有荧光素，地高辛和生物素等，尽管其敏感性不如放射性标记探针，但因其性能稳定，操作简便，成本低和耗时短等长处，正越来越广泛的得到应用。对双链cDNA的探针的标记可用缺口平移或随机引物法；单链cRNA探针可通过转录进行标记；合成寡核苷酸探针可用5’末端标记法。 原位杂交的主要程序 原位杂交的实验材料可以是常规石蜡包埋组织切片，冰冻组织切片，细胞涂片和培养细胞爬片等。主要程序包括杂交前准备、预处理、杂交、杂交后处理—清洗和杂交体的检测等。操作中应注意的问题有：①对DNA—RNA杂交和RNA—RNA杂交，需进行灭活RNA酶处理水（包括0.5‰的二乙基焦碳酸盐（diethylpyrocarbonate,DEPC）配制有关试剂和160∽180℃烘烤实验用器皿等）；当使用双链cDNA探针和∕或待测靶序列是DNA时，需进行变性处理使DNA解链；②杂交温度应低于杂交体的解链温度（Tm）25℃左右；③对照实验：原位杂交较免疫组化染色复杂，影响因素颇多，故对照实验是必不可少的，有组织对照，探针对照，杂交反应体系和检测系统对照等，可根据具体情况选用。 荧光原位杂交 可以用直接法或间接法进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH），前者是以荧光素直接标记已知DNA探针，在桥连一个荧光标记的抗体。FISH检测的靶序列也是DNA，