种子扩大培养与污染检测与判别.docVIP

种子的扩大培养及污染的检测和判别 摘要：微生物工业发酵过程中，为增加接种量,缩短发酵时间、保证生产水平，需要对种子进行扩大培养。同时，为提高产率及质量，经常采用纯种发酵,因此,纯种的制备及污染检测是微生物发酵中重要的一道工序。 本实验以大肠杆菌为研究对象，通过对其进行扩大培养和污染的检测和判别，了解种子扩培的基本方法及影响种子质量的主要因素以及发酵污染的危害。发酵过程中，本实验采用了染色镜检、平板检查法及肉汤培养检查法相结合的方式进行杂菌检测。 关键词：活化培养 扩大培养 染色镜检 平板检查 肉汤培养检查 现代工业的生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十甚至几百立方米。因此要在短时间内完成发酵，必须要有数量巨大的微生物细胞才行。种子扩大培养的任务就是要获得数量足够的健壮的微生物。种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。微生物工业自从采用纯种发酵以来，产率有了很大的提高，然而防止杂菌污染的要求也更高了。人们在与杂菌污染的斗争中，积累总结出很多宝贵的经验。规范了管理措施，设计了一系列设备（例如密闭式发酵罐，培养基灭菌设备，无菌空气制备设备等）和管道，应用了无菌室甚至无菌车间，建立了无菌操作技术，因而大大降低了发酵染菌率。但是某些发酵工业还遭受着染菌的威胁，染菌后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐” ，不但 浪费大量原材料，造成严重的经济损失，还会对周围环境造成破坏。凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌并采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。因此检查的方法要求准确、快速。发酵污染可发生在各个时期。种子培养期染菌的危害最大，因严格防止。一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。发酵前期养分丰富，容易染菌，此时养分消耗不多，应将发酵液补足必要养分后迅速灭菌，并重新接种发酵。发酵中期染菌不但严重干扰生产菌株的代谢，而且会影响产物的生成，甚至使已形成的产物分解。由于发酵中期养分已被大量消耗，代谢产物的生成又不是很多，挽救处理比较困难，可考虑加入适量的抗生素或杀菌剂。如果是发酵后期染菌，此时产物积累已较多，糖等养分已接近耗尽，若染菌不严重，可继续进行发酵；若污染严重，可提钱放罐。染菌程度越重，危害越大；染菌少，对发酵的影响就小。所以，实际生产中，应当根据污染程度和发酵时期区别对待。 1 实验器材与试剂 1.1 器材 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜、天平、三角瓶、试管、移液管、培养皿、 接种针、平板涂布器、酒精灯、载玻片 1.2 试剂 营养琼脂、葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红染液、香柏油、擦镜液 1.3培养基 (1)营养琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉4.5g，溶于100mL蒸馏水配制，pH7.2，分装到试管中， 灭菌后摆成斜面。 (2)种子培养基：葡萄糖 0.5%、磷酸二氢氨 0.1%、七水合硫酸镁 0.02%、氯化钠 0.5%、磷酸氢二钾 0.1% (3)葡萄糖酚红肉汤培养基： 牛肉膏 0.3%、蛋白胨 0.8%、 葡萄糖 0.5%、 氯化钠 0.5%、 0.4% 酚红溶液，pH7.2 2实验方法 2.1种子的扩大培养 2.1.1斜面培养基的配制 配制营养琼脂培养基，分装，灭菌（121℃条件下灭菌 30min），倒斜面。 2.1.2菌种的活化 ⑴将大肠杆菌采用无菌操作的方法接种于斜面上，37 ℃下培养18h； ⑵培养 18h 后，观察菌落颜色是否一致，若均为黄色，挑取培养皿周边的菌落进行无菌检测；若颜色有黄有白，则两种颜色的菌落均要进行无菌检测。检测方法常用染色镜检，若检测后，没有污染，便可进行扩大培养；若检测到杂菌，要重复上述步骤，直到无菌为止，否则，不能继续下一步操作。 2.1.3扩大培养 在无菌条件下，从检测后的活化培养基上挑取10个左右菌落，用接种针接种到扩大培养基(即种子培养基)中，于 37℃ 下振荡培16-18h，观察菌落形态。然后配合显微镜形态观察，根据结果来判断能否进行下一步。 2.2污染的检测和判别 2.2.1显微镜检查 ⑴取样：用无菌操作方式取发酵液少许,涂布在载玻片上； ⑵制片、染色：自然风干后,用番红染液染色 1-2min，水洗； ⑶干燥后用油镜下观察。 2.2.2平板检查 ⑴配制营养琼脂培养基，灭菌，倒平板； ⑵取少量待检发酵液经稀释 (大约 10–6～10–7) 后涂布在营养琼脂平板上，在 37℃下培养 24h； ⑶观察菌落形态。 2.2.3肉汤培养检查法（用于检