致病菌毒力基因的系统筛选基本方法.ppt

致病菌毒力基因的系统筛选方法;毒力基因的定义/标准;;病原菌有多少毒力基因?;近年发展的毒力基因筛选技术;转座的概念 细菌转座元件的类型 细菌转座的机制及其遗传学效应 细菌转座的应用 ;一、什么是转座？;转座特点：;Ac / Ds Transposons in Maize; 转座现象广泛存在;三、细菌转座元件的类别;（一）插入序列 Insertion Sequence（IS） 是最简单的可移动片段，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分； 是一个自主的单位，由一段编码转座酶的DNA序列和两端的反向重复序列（inverted repeat sequence）组成；IS转座频率为10-3～10-4/世代。 命名方式： IS＋编号 长度 700～2000bp;每种IS元件具有不同序列，但有共同的组织形式;（二） 类插入序列 IS-like elements 结构和IS相似，但不独立存在，而是作为复合转座子两臂的组件。;（三） 复合转座子 Composite Transposon 命名：通常以Tn加上数字表示，如Tn903。 结构: 1. 两侧重复顺序就是IS或者类IS。 2. 除转座酶基因外还有其它表型基因， 如：耐药基因，使宿主具表型效应。;;;（四） TnA家族： 两端为IR（Inverted repeats）而非IS 中间的编码区不仅编码抗性标志，还编码转座酶和解离酶； 进行复制性转座，分为两步，分别由转座酶和解离酶完成。 如：Tn3和Tn1000;（五）转座噬菌体 Mu Bacteriophage（巨型转座子 ） 噬菌体 Mu是一个特殊的噬菌体，可以感染大肠杆菌；有裂解和溶原两个生活周期； Mu前噬菌体整合到宿主染色体上的方式不是位点特异性重组，而是随机的转座机制。 随着噬菌体的复制，新的拷贝以复制转座方式随机插入到宿主菌染色体各处不同位置。;四、细菌转座元件的转座机制及遗传学效应; ?1． 非复制性转座（nonreplicative transposition） ? 这类转座因子直接从原位点移到靶位点，同时在供体留下产生一个双链断裂的位点，这种类型的机制只需要转座酶，这个双链断裂位点需要修复系统的识别和修复。; 转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供体原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。 ; 转座的遗传学效应：;转座子的应用：;五、细菌转???子的应用;应用举例1高通量地筛选与某种特定功能有关的基因;构建克雷伯菌的转座突变株库;构建转座突变株库;1 tnp: transposase 转座酶 2 反向重复序列，Km耐药基因 3 ori R6K:复制起点，只能在表达π蛋白 的细菌中复制。 （成为自杀质粒） 　在大肠杆菌SM10(λpir)中复制 4 mob RP4:编码与接合有关的酶，使质粒 通过接合方式传递给受体菌。;大肠杆菌;;生物膜形成能力的检测; localization of the mutation genes ;Strain;转座子的优点;转座子的优点;转座子随机突变技术的缺点;讨论;应用举例2快速构建完整单基因突变株库;两种转座子，避免插入的热区;流程示意图;随机引物PCR扩增突变基因序列;突变株库的筛选规模;The PA14 Transposon Insertion Mutant Database (/cgi-bin/pa14/mutants/retrieve.cgi);应用举例3 STM法筛选病原菌毒力基因 STM(signature tagged mutagenesis);标签标记突变技术(STM）;;;Results of colony hybridization;第二节 体内诱导基因的筛选技术;筛选体内诱导基因的方法;;;;;肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae CG43体内诱导基因的筛选;the promoterless galU gene as a dual-function reporter;Ivi gene;IVET是最佳的筛选体内诱导基因的方法。 但IVET方法需要动物模型，不适用于没有动物模型的致病菌研究，例如伤寒沙门菌只对人致病，采用IVET方法就无法进行研究。 体内诱导抗原鉴别技术（In vivo induced antigen technology，IVIAT）;IVIAT法的技术路线图;pET30a/b/c载体系统示意图; 该系统由3个质粒构成，相对于BamHⅠ克隆位点识别序列GGATCC的阅读框，带后缀a的载体从GGA三联密码子开始表达，带b的从GAT开始，带c的