血清白蛋白的分离以及纯化、蛋白定量测定.ppt

血清白蛋白的分离与纯化、蛋白定量测定 实验目的 掌握DEAE纤维素层析法分离纯化蛋白的方法 掌握考马斯亮兰法测定蛋白质的原理 DEAE纤维素层析法分离纯化白蛋白 离子交换层析基本原理 根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式 离子交换剂 离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）和反离 子组成。基质一般是不溶性聚合物，如纤维素，交联葡聚糖， 交联琼脂糖等； 树脂 －O — N+(CH3)2 — OH- 纤维素－O — CH2— COO-— Na＋ 基质 电荷基团 反离子 阳离子交换剂 阴离子交换剂 离子交换剂的选择 考虑因素： 1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量 对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及溶液的pH值。 离子交换纯化原理 如果要分离纯化一种具有兼性离子特性的生物大分子， 其离子化的程度取决于它所在溶液中的净电荷。 生物分子带电荷与否，或带什么样的电荷，主要决定于溶液的pH值。 溶液的pHpI，生物大分子带负电荷，解离成负离子 溶液的pHpI，生物大分子带正电荷，解离成正离子 pHpI pH=pI pHpI 人血清蛋白质的等电点及分子量 蛋白质 等电点 分子量 白蛋白 4.88 69000 α1-球蛋白 5.06 200000 α2-球蛋白 5.06 300000 β-球蛋白 5.12 9000-150000 γ-球蛋白 6.85-7.50 156000-300000 实验步骤 装柱：取一根1cm×2cm的层析柱垂直夹在铁架上，注入1cm高的0.02mol/L pH6.5NH4Ac缓冲液。将已处理浸泡在0.02mol/L pH6.5NH4Ac缓冲液中的DEAE纤维素搅成悬浮状(沉淀的纤维素与NH4Ac溶液体积比为1:2)，加入层析柱内，慢慢打开底部出口，同时不断加入DEAE纤维素直至柱高10cm。 平衡：纤维素柱床上留有3cm高的溶液，将层析柱两头旋紧，接上恒流泵，用0.02mol/L pH6.5NH4Ac缓冲液平衡20min(流速为1ml/min,层析柱两头要旋紧，防止柱床流干) 洗脱：平衡完成后，旋下上塞，慢慢打开底口使纤维素床上的液面下降到与床面相齐，夹住底口。将样品Ⅳ加到纤维素柱上，打开底口使样品Ⅳ进入到床体，直到与床面相齐，吸1.0ml 0.02mol/L pH6.5NH4Ac溶液，沿柱壁慢慢加入纤维素床面上(三次，操作同上)，洗净沾在柱壁上的蛋白液。在纤维素床面上加3cm高的0.02mol/L pH6.5NH4Ac溶液，将层析柱两头柱塞旋紧，接上恒流泵，用0.06~0.5mol/L pH6.5NH4Ac溶液进行梯度洗脱(流速为1ml/min)。Ⅰ室加入0.06mol/L pH6.5NH4Ac溶液200ml，Ⅱ室加入0.5mol/L pH6.5NH4Ac溶液200ml。 考马斯亮兰法测定蛋白质 实验原理： 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质与染料结合的原理定量测定微量蛋白浓度的方法。这种蛋白质测定法快速、灵敏、优点突出，因而得到广泛的应用。考马斯亮蓝法是目前灵敏度最高的蛋白质定量方法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（max）位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色也由棕黑色变为兰色。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合。在595 nm下测定的吸光值A595，与蛋白质浓度成正比。 实验步骤 1、标准方法 (1)具体测定按下表操作(待测样品的加样量见下表的第8、9、10管) 加入物(ml) 1 2*2 3*2 4*2 5*2 6*2 7*2 8*2 9*2 10*2 标准蛋白 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 - - - 待测蛋白 - - - - - - - 0.02 0.04 0.06 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 边加边混匀，2-3分钟后，以1号管为空白对照，测定各样品在595nm处的光吸收值A595 注意事项： 最好在试剂加入后的5-20min内测定吸光值，因为这段时间内颜色最稳定 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附在比色杯壁中，不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料