蛋白质的理化性质与分离纯化讲义.pptVIP

蛋白质的理化性质及分离纯化;第一节 蛋白质的理化性质;第一节 蛋白质的理化性质;一、蛋白质的酸碱性质;一、蛋白质的酸碱性质;二、蛋白质的紫外吸收性质;三、蛋白质的胶体性质和沉淀;（二）蛋白质的沉淀;　盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(如：硫酸铵,硫酸钠或氯化钠等),使蛋白质表面的电荷被中和，蛋白质分子脱去水化层而聚集沉淀。;2.　有机溶剂沉淀法;3.　重金属盐沉淀法;4.　生物碱试剂和某些酸类沉淀法;5.　加热变性沉淀法; 蛋白质沉淀的应用（制作豆腐）;四、蛋白质的变性和复性;茚三酮反应（ninhydrin reaction)： 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可以与茚三酮发生反应呈现蓝色。;蛋白质的呈色反应;蛋白质的理化性质;第二节 　蛋白质的分离纯化; 蛋白质在组织和细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都会含上千种不同的蛋白质。; 到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中纯化出来。 但对任何一种蛋白质都可能选择一套适当的分离纯化程序以获得高纯度的制品。; 一、蛋白质分离纯化的一般步骤;一、蛋白质分离纯化的一般步骤;(1) 去除杂质。 (2) 细胞破碎。 (3)　溶　提：选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。 ;2.蛋白质粗提液的粗分级分离;3.浓缩蛋白质的细分级分离;4. 蛋白质的结晶; 一、蛋白质分离纯化的一般步骤;二、蛋白质的分离纯化方法;（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法;1：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）; 将浓缩液装在一个用半透膜的透析袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有缓冲液的容器内进行透析。 　由于透析袋内溶液浓度高而袋外浓度低，因此，透析袋内外将进行物质交换，袋内溶质向袋外渗透，趋向浓度平衡。; 蛋白质等大分子不能透过半透膜，仍然留在袋内。 但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交换。 通过多次更换透析液，就可除去小分子。;超过滤装置;2：密度梯度（区带）离心;?装好具备密度梯度的介质溶液;3：凝胶过滤法;（1）凝胶过滤的介质; Sephadex 交联葡聚糖 Bio-gel P 聚丙烯酰胺凝胶 Sepharose或Bio-gel A 琼脂糖凝胶;（３）凝胶过滤的原理：;凝胶过滤分离蛋白质的流程;这样大小不同的蛋白质就被分离开来了。;（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法;（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法 （蛋白质的胶体和沉淀性质）;1.等电点沉淀和PH值控制;1.等电点沉淀和PH值控制;2.蛋白质的盐溶和盐析;　盐析（salting-out） ：当溶液中的离子强度达到一定的数值时（盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。;3.有机溶剂分级分离法;4.改变温度分离蛋白质;（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法 （蛋白质的胶体和沉淀性质）;（三）根据蛋白质电荷不同的纯化方法;电泳概述;电泳概述;电泳分类;按有无支持物分类：;应用于蛋白质分离纯化中的电泳;区带电泳： 在支持物上电泳蛋白质混合物,将其分离成若干区带;1.聚丙烯酰胺凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点： 聚丙烯酰胺化学性能稳定。 聚丙烯酰胺在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，易观察，可用检测仪直接测定。 聚丙烯酰胺凝胶孔径可调，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径大小。 分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，有更高的分辨率。;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS);浓缩胶;点样;浓缩胶;电泳结果;2.毛细管电泳;3.等电聚焦电泳; 实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。;;4.蛋白质的双向电泳（two-dimensional electrophoresis）; 双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。 所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。;是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。;; 填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。;以阳离子交换型树脂为例;结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式： ;;; 利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。; 亲和层析(affinity