cs-acs3基因克隆与表达载体的构建-西南大学.docVIP

Cs-ACS1基因克隆与转化黄瓜研究 曲淑娟 宋波 夏蓓蓓 苏承刚 张兴国* （西南大学园艺园林学院，重庆400715） 摘 要：采用PCR方法，从全雌系黄瓜基因组DNA扩增2333 bp的基因片段，BLAST分析结果表明:所克隆的基因序列Cs-ACS1仅有1个碱基的差异，与Cs-ACS1G的序列同源性，表明所克隆的基因为Cs-ACS基因构建表达载体， 关键词：Cs-ACS1基因Cs-ACS1、Cs-ACS2、Cs-ACS3、Cs-ACS4基因[5]。其中，最早克隆的黄瓜ACC合成酶基因（Cs-ACS1）受生长素等诱导，却与雌性表现无关；通过Southern杂交显示存在一个与之同源的、与雌性控制F位点紧密连锁的基因Cs-ACS1G，此基因与雌性系有相关关系。叶波平等[6]从不同性别表型的黄瓜基因组中扩增出一条雌性系黄瓜所特有Cs-ACS1G基因，说明除此基因参与黄瓜的雌性表达外，还有其它参与雌性表达的基因。陈惠明[7]以不同性别类型的黄瓜为材料，证明Cs-ACS1G 基因对具有F基因的不同性型植株的特异性的确存在。Mibus [8]提出Cs-ACS1G 基因为雌性系和亚雌性系特有，其中亚雌性系基因型为F/f。程立宝[9]也明确的指出Cs-ACS1G 基因是雌性系特有基因，它控制黄瓜性型分化。迄今为止，关于控制黄瓜雌性系的基因研究还停留在理论水平，还没有明确的报道。本克隆黄瓜C-ACS1基因，黄瓜性别分化，培育雌性系材料等方面。pMD18-T载体购自TaKaRa公司。 1.2 Cs-ACS1基因的克隆 以全雌系黄瓜Cs0401gDNA为模板，以P1（CCCATCTTCTCTAACCCCTCCTG）和P2（CCAGGCTATCGTTCATAATGGAG）为引物，采用PrimStar HS DNA 聚合酶（TaKaRa Co.，Japan）进行PCR扩增。扩增条件为：98℃ 1 min，1个循环；98℃ 10 sec，56.6℃ 15 sec，72℃ 2 min 20 sec，30个循环；72℃最后延伸10 min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收，Taq DNA聚合酶加“A”尾，TA克隆到pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。委托上海生工生物技术有限公司对阳性克隆(pMD-CsACS1)测序。 1.3 植物基因表达载体的构建与导入根癌农杆菌 用限制性内切酶XbaⅠ和SalⅠ酶切pMD-CsACS1，回收小片段；同时用XbaⅠ和SalⅠ酶切pVCT2102，回收大片段。经T4 DNA连接酶过夜连接，转化大肠杆菌，筛选植物基因表达载体pVCT2214。采用冻融法将该载体转化进根癌农杆菌菌株EHA105中，并以P3（CTTCGGTTGTGCTGCTAATAAGC）和P4（ACGATCCAGATCCGGTGCA）、P1和P5（CAACGGCATCATTCAGATGG）进行PCR扩增鉴定。 1.4 黄瓜的遗传转化、培养及鉴定 以萌发2天的强雌黄瓜Cs0837成熟子叶为材料，采用农杆菌介导法转化，参照本实验室的方法培养和筛选[10]。芽分化培养基为MS附加2 mg·L-1 6-BA、1 mg·L-1 KT、2 mg·L-1 AgNO3、90 mg·L-1 卡那霉素、30% 蔗糖、0.6% 琼脂（pH 5.8）。试管苗长至1 cm左右时，转到MS附加0.5 mg·L-1 6-BA的培养基中促进生长。试管苗长至3 cm左右时，在MS附加0.5 mg·L-1 NAA中生根，生根后转到MS基本培养基中培养。卡那霉素抗性植株移栽成活后，以P2和P4为引物对进行PCR扩增鉴定。 2 结果分析2.1 Cs-ACS1基因的克隆与序列分析 以全雌系黄瓜Cs0401的gDNA为模板、P1/P2为引物，扩增出约2.3 kb的预期带（图1A）。克隆到pMD18-T载体，经PCR筛选阳性克隆（图1B），获得重组质粒pMD-CsACS1。双向测序结果显示，所克隆的序列全长2333 bp。同源性分析：与GenBank公布的Cs-ACS1 (DQ839409仅有个碱基Cs-ACS1G（DQ839410）的同源性；但推导的氨基酸序列与Cs-ACS1Cs-ACS1G的没有差异Cs-ACS1基因。 2.2 植物基因表达载体pVCT2214的构建及导入根癌农杆菌 用引物P3/P4进行菌落PCR扩增，得到850 bp预期片段（图2B）；用XbaⅠ和SalⅠ对pVCT2214进行双酶切得到8853 bp和2117 bp的两个预期条带(图2C)，表明Cs-ACS1因的植物表达载体pVCT2214（图2A）构建成功。 pVCT2214转化农杆菌EHA105后，用引物P1/P5（图2D）、P3/P4(图2E）进行菌落PCR扩增筛选，分别得到约1500