5基因工程操作的工具酶演示教学.ppt

基因工程的工具酶; ; 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、进而产生生物工程产品。 ;基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。; 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己 DNA 的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。; 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶 甲基化酶 核酶 ;限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。;何谓限制性核酸内切酶？是如何发现的…….;寄主控制的限制（restriction） 与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。; ? 细菌的限制—修饰作用;限制与修饰系统 ;噬菌体侵染细菌;寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶; R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。细菌 R-M 系统的限制酶可以降解外源 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。;　 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。;限制性内切酶的发现 限制性内切酶的分类 限制性内切酶的命名以及识别特点 Ⅱ型限制性内切酶的切割方式 Ⅱ型限制性内切酶的反应条件 影响限制性内切酶活性的因素;1968 Linn 和 Arber 从 E.coli B 中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1971年，D. Nathans用HindII绘制了猿猴病毒SV40的限制酶谱 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans 因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖 。;到1986 年下半年，发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶。 到 2006 年2 月，共发现 4583 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3773 种，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有 68 、3692 、10 种。;限制性核酸内切酶（限制酶）： 　　在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。;根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶 ;Ⅰ型限制酶（无用） 1968年，M. Meselson和R. Yuan在E.coli B和E.coli K中分离出的核酸内切酶。 分子量：30万dal左右 组成：3种亚基 特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。 修饰亚基：具甲基化酶活性。 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM。 识别和切割位点：不一致（距识别位点5’一侧数千碱基处随机切割DNA分子）。;Ⅱ型限制酶（十分有用） 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量：2万～10万dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。 识别和切割位点：相一致。;Ⅲ型限