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啤酒酵母蔗糖酶提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验;正交试验法;一、目的要求; ; 二、实验对象; 该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧； 在细胞膜外细胞壁中的称之为膜外蔗糖酶 (external yeast invertase), 其活力占总酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白； 在细胞膜内侧细胞质中的称之为膜内蔗糖酶 (internal yeast invertase)，含有少量的糖；; 这两种酶组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，故本实验未区分膜内酶与膜外酶。; 三、实验步骤及原理;基本特征：单细胞，椭圆形、圆形或柱形。 酵母菌细胞壁具三层结构——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，都是复杂的分枝状聚合物，其间夹有一层蛋白质分子。 ;细胞破壁的方法;（1）高速组织捣碎： 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 （2）玻璃匀浆器匀浆： 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。;（3）超声波处理法： 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常选用浓度为 50-100 毫克/毫升菌体，在 30 至 60Hz 频率下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。 （4）反复冻融法： 将细胞在 -20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。;（5）化学处理法： 有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠 (SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。 （6）溶胞作用 (酶溶解法)： 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 （7）自溶法（本实验）： 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。;干酵母粉;2、蔗糖酶的纯化;E1;酶的蛋白属性 两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液 pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 等电点 (isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。; 大分子(胶体) 分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达 1～100nm，为胶粒范围之内。 稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜;+;（1）有机溶剂分级沉淀 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。 乙醇、丙酮是最常用的沉淀溶剂。; 有机溶剂分级沉淀操作条件的控制 溶剂选择 常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。 温度 使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。 样品浓度的控制 一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2% 为好，粘多糖则以1%-2% 较合适。;（2）透析 利用具有一定孔径的亲水膜，在常压下依靠小分子物质的扩散运动，将含有高分子和其他小分子的溶液与纯水或缓冲溶液分隔的一种方法. 透析的动力是由膜两边的浓度梯度形成扩散压。其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。常用温度：4℃。 保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。 ; 新透析袋可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净。使用时，一端用橡皮筋或透析袋夹扎紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留 1/3-1/2 的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。 ;（3）离子交