脆性 X 综合征（FXS）的基因检测.pdf

脆性X 综合征（FXS）的基因检测 [教学对象与学时] 1．教学对象：四年制本科 2．学时：4 学时 [预习要求] 预习脆性X 综合征基因检测方法 [教学目的] 1．操作： 掌握荧光PCR 检测脆性X 前突变的操作规范； 学习脆性X 综合征Southern Blot 基因检测方法。 2．理论： 全面掌握脆性X 综合征相关的临床表现、遗传病理及诊断方法等； 了解Southern Blot 检测原理。 [教学重点] 1．正确掌握荧光PCR 检测操作规范； 2．理解Southern Blot 检测原理。 [教学难点] 1. 准确掌握荧光PCR 检测脆性X 前突变的操作要点； 2. 了解脆性X 综合征动态突变机制及Southern Blot 检测原理。 [教学过程设计] 1. 课前提问和预习检查。 2. 讲解脆性X 综合征相关临床表现、遗传病理与基因检测方法等。 3. 介绍荧光PCR 基本操作规范。 4. 示范运用荧光PCR 进行脆X 基因检测的实验流程。 5. 讲解实验可能出现的结果及其原因。 [课前预习检查] 1. 何谓脆性X 综合征？有何明显临床表现？ 2. 目前主要运用什么方法行基因检测？ [课前讲解] 1．疾病概述：脆性X 综合征（Fragile X Syndrome ，OMIM ：300624 ）是最常见的X 连锁的 单基因智力低下综合征，发病率仅次于 21-三体综合征。超过 95% 的脆性 X 综合征是由于 (CGG)n 重复扩展的动态突变和异常甲基化而导致的 FMRP 蛋白合成减少或缺失所致，不到 5%的患者是由于FMR1 基因的点突变或缺失突变而导致FMRP 蛋白功能异常而致病。群体发 病率：男性全突变率 1:4000，女性全突变率 1:6000～8000，男性前突变携带者 1:800，女 性前突变携带者1:260。台湾筛查10046 名男性新生儿发现全突变率1/10046，前突变携带 率为1/1674，过渡区基因携带率1/143。 2 ．遗传病理学 2 ．1 发展背景：1943 年，Martin 和Bell 首次发现脆性X 综合征，在该家系中有11 名男性 严重智力低下、精神发育迟缓（mental retardation，MR），存在语言障碍和行为问题，2 名 女性轻度智力低下；1969 年，Lubs 在2 个具X 连锁智力低下的无血缘关系的家系中，发现 均带有一条长臂末端具随体样结构的C 组染色体，并经放射自显影证实为X 染色体，称为“标 记X 染色体”并认为这种标记X 染色体与智力低下相关；1977 年，Sutherland 将脆性部位 （fragile site ）定位于Xq27 ，脆性X 综合征因此得名；1991 年，Verkerk 等在Xq27.3 附近成 功克隆出脆性X 综合征致病基因，命名为脆性X 智力低下基因1FMR1 。 2 ．2 基因结构：FMR1 定位在Xq27.3 ，基因长约38kb，由17 个外显子和16 个内含子组成， 其5 ＇端第一外显子上的非翻译区有一个(CGG)n 三核苷酸串联重复序列，重复序列中每9-10 个CGG 重复有1 个AGG 嵌入，(CGG)n 在重复片段长度和AGG 嵌入模式上都存在多态性， 在其上游大约250bp 处有一个CpG 岛，如图1。 图1：FMRP 结构示意图及CGG 重复位置图 2 ．3 发病机制：FMR1 编码脆性X 智力低下蛋白（FMRP），它是一种RNA 结合蛋白，存在 于许多组织，以人脑组织海马区、皮质灰质部的浦肯野氏细胞、表层及颗粒层神经元。睾丸 组织精原细胞表达最强。在哺乳动物大脑中，FMRP 参与了4%左右的mRNA 的选择性结合， 包括它自己的mRNA.。FMRP 为71kDa 的蛋白，且有几种剪接类型。图1 中可见FMRP 蛋白 有三个 RNA 结合区域：8 和 10 号外显子上各有 1 个 KH （heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K homology ）结构域，15 号外显子为一精-甘-精氨酸RGG 结合box，蛋白 区氨基末端RNA 结合区。其中还有一个核定位信号（NLS）和一个核输出信号(NES)，可以穿 梭于核与胞质之间。FMRP 能够和特定的mRNA 结合，并将之